Metabolit imunomodulator adolah ciri kunci dari lingkuangan mikro tumor (TME), tapi jo babarapo pangacualian, identitasnyo tatap sabagian gadang alun dikatahui. Di siko, kami manganalisis tumor jo sel T dari tumor jo asma pasien karsinoma serous tingkek tinggi (HGSC) untuak mangungkapkan metabolom dari kompartemen TME nan babeda ko. Asma jo sel tumor mampunyoi pabedaan metabolit nan laweh. Dibandiangkan jo asma, sel T nan manyusup ka tumor sacaro signifikan dikayai jo 1-metilnikotinamida (MNA). Walaupun tingkek MNA pado sel T maningkek, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim nan mangatalisis pamindahan gugus metil dari S-adenosilmetionin ka nikotinamida) tabateh pado fibroblas jo sel tumor. Sacaro fungsional, MNA manginduksi sel T untuak mangaluaan faktor nekrosis tumor sitokin nan mampromosikan tumor. Dek karano itu, MNA nan barasa dari TME mambarikan kontribusi pado pangaturan imun sel T jo mawakili target imunoterapi nan bapotensi untuak ubek kanker manusia.
Metabolit nan barasa dari tumor dapek mampunyoi efek panghambat nan mandalam pado imunitas anti-tumor, dan samakin banyak bukti nan manunjuakan baso inyo dapek juo bafungsi sabagai padoman kunci untuak kamajuan panyakik (1). Salain efek Warburg, karajo nan baru-baru ko mulai mancirikan kaadaan metabolisme sel tumor jo hubungannyo jo kaadaan imun lingkuangan mikro tumor (TME). Panalitian pado model tikuih jo sel T manusia alah manunjuakan baso metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) jo metabolisme glukosa (4) dapek batindak sacaro mandiri pado babagai subkalompok sel imun. Babarapo metabolit pado jalur iko mangambati fungsi anti-tumor sel T. Alah tabukti baso blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) dapek marusak proliferasi sel T, jo paningkekan BH4 dalam tubuah dapek maningkekan tanggapan imun anti-tumor nan dimediasi dek CD4 jo CD8. Salain itu, efek imunosupresif dari kynurenin dapek disalasaikan jo pamakaian BH4 (5). Pado glioblastoma mutan isositrat dehidrogenase (IDH), sekresi enantiometabolik (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) mangambati aktivasi sel T, proliferasi jo Aktivitas sitolisis (6). Baru-baru ko, alah ditunjukkan baso metilglioksal, produk sampiangan dari glikolisis, dihasiakan dek sel-sel supresor nan barasa dari mieloid, jo pamindahan sel T dari metilglioksal dapek mangambati fungsi sel T efektor. Dalam ubek, netralisasi metilglioksal dapek mangatasi aktivitas sel panakan nan barasa dari mieloid (MDSC) jo sacaro sinergis maningkekan terapi blokade pos pamariksaan pado model tikuih (7). Panalitian ko sacaro kolektif manakankan peran kunci metabolit nan barasa dari TME dalam maatur fungsi jo aktivitas sel T.
Disfungsi sel T alah banyak dilaporkan pado kanker ovarium (8). Hal iko sabagian disababkan dek ciri-ciri metabolisme nan ado pado hipoksia jo pambuluah darah tumor nan indak normal (9), nan maakibaikan parubahan glukosa jo triptofan manjadi produk sampiangan sarupo asam laktat jo kynurenin. Laktat ekstraseluler nan bakalabiahan mangurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) jo mandorong diferensiasi subkalompok mielosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan langsuang mangambati proliferasi sel T jo mangambati sinyal reseptor sel T (12-14). Walaupun ado pangamatan iko, banyak karajo mangaliliangi metabolisme imun dilakukan dalam kultur sel T in vitro manggunoan media nan dioptimalkan, atau tabateh pado model tikuih homolog dalam vivo, indak ciek juo nan sapanuahnyo mancaminkan heterogenitas kanker manusia jo lingkuangan makro jo mikro Fisiologis.
Ciri umum kanker ovarium adolah panyebaran peritoneum jo muncuanyo asma. Akumulasi cairan sel pado asma takaik jo panyakik nan alah lanjut jo prognosis nan buruak (15). Manuruik laporan, kompartemen unik ko hipoksik, mampunyoi kadar faktor patumbuahan endotel pambuluah darah (VEGF) jo indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO) nan tinggi, sarato diinfiltrasi dek sel pangaturan T jo sel panghambat mieloid (15-18). Lingkuangan metabolisme asma mungkin babeda jo tumor itu surang, sahinggo pamrograman ulang sel T di ruang peritoneum indak jaleh. Salain itu, pabedaan kunci jo heterogenitas antaro asma jo metabolit nan ado pado lingkuangan tumor dapek mahalangi infiltrasi sel imun jo fungsinyo pado tumor, dan diparaluan panalitian labiah lanjuik.
Untuak manyalasaian masalah-masalah iko, kami marancang pamisahan sel sensitif jo metode spektrometri massa tandem kromatografi cairan (LC-MS/MS) untuak mampalajari jinih sel nan babeda (tamasuak sel T CD4 + jo CD8 +) sarato di dalam jo antaro tumor Metabolitnyo mancakuik sel-sel di asma nan samo jo lingkuangan pasien tumor. Kami manggunoan metode ko dalam kaitannyo jo sitometri aliran dimensi tinggi jo urutan RNA sel tungga (scRNA-seq) untuak manyadiokan potret nan sangaik disalasaikan dari status metabolisme populasi kunci ko. Metode iko mangungkapkan paningkekan signifikan pado kadar 1-metilnikotinamida (MNA) pado sel T tumor, jo pacobaan in vitro manunjuakan baso efek imunomodulator MNA pado fungsi sel T sabalunnyo alun dikatahui. Sacaro umum, metode ko mangungkapkan interaksi metabolisme nan saliang antaro tumor jo sel imun, jo mambarikan wawasan unik tantang metabolit pangaturan imun, nan mungkin baguno untuak ubek imunoterapi kanker ovarium babasis sel T Peluang ubek.
Kami manggunoan sitometri aliran dimensi tinggi untuak sacaro sarantak mangukua pangambilan glukosa. panando khas nan mambedakan sel imun jo populasi sel tumor (Tabel S2 jo Gambar S1A). Analisis ko manunjuakan baso dibandiangkan jo sel T, asma jo sel tumor mampunyoi tingkek pangambilan glukosa nan labiah tinggi, tapi mampunyoi pabedaan nan labiah ketek dalam aktivitas mitokondria. Rato-rato pangambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] adolah tigo inggo ampek kali lipek dari sel T, dan rato-rato pangambilan glukosa sel CD4 + T adolah 1,2 kali lipek dari sel CD8 + T, nan manunjuakan limfosit nan manyusup tumor pado TME mamaralukan metabolisme nan babeda. Sabaliaknyo, aktivitas mitokondria pado sel tumor sarupo jo sel CD4 + T, jo aktivitas mitokondria pado kaduo jinih sel labiah tinggi daripado sel CD8 + T (Gambar 1B). Sacaro umum, hasil iko mangungkapkan tingkek metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor labiah tinggi daripado sel CD4 + T, dan aktivitas metabolisme sel CD4 + T labiah tinggi daripado sel CD8 + T. Walaupun efek iko di saluruah jinih sel, indak ado pabedaan nan konsisten pado status metabolisme sel T CD4 + jo CD8 + atau proporsi relatifnyo pado asma dibandiangkan jo tumor (Gambar 1C). Sabaliaknyo, pado fraksi sel-CD45, proporsi sel EpCAM+ pado tumor maningkek dibandiangkan jo asma (Gambar 1D). Kami juo mangamati pabedaan metabolisme nan jaleh antaro komponen sel EpCAM+ jo EpCAM-. Sel EpCAM+ (tumor) mampunyoi pangambilan glukosa jo aktivitas mitokondria nan labiah tinggi daripado sel EpCAM-, nan jauah labiah tinggi daripado aktivitas metabolisme fibroblas pado sel tumor pado TME (Gambar 1, E jo F).
(A jo B) Intensitas fluoresensi median (LKM) pangambilan glukosa (2-NBDG) (A) jo aktivitas mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker merah tua) (B) Grafik perwakilan (kiri) jo data tabulasi (Kanan), sel CD8 + T jo sel tumor EpCAM + CD45-. (C) Rasio sel CD4 + jo CD8 + (dari sel CD3 + T) pado asma jo tumor. (D) Proporsi sel tumor EpCAM + pado asma jo tumor (CD45−). (E jo F) Pangambilan glukosa matriks tumor jo matriks CD45 (2-NBDG) (E) jo aktivitas mitokondria (MitoTracker merah tua) (F) grafik perwakilan (kiri) jo data nan ditabulasi ( Kanan) Asma jo sel tumor. (G) Grafik perwakilan ekspresi CD25, CD137 jo PD1 jo sitometri aliran. (H jo ambo) ekspresi CD25, CD137 jo PD1 pado sel T CD4 + (H) jo sel T CD8 + (Ambo). (J jo K) Fenotipe naif, ingatan sentral (Tcm), efektor (Teff) jo ingatan efektor (Tem) badasarkan ekspresi CCR7 jo CD45RO. Gambar perwakilan (kiri) jo data tabular (kanan) sel T CD4 + (J) jo sel T CD8 + (K) pado asma jo tumor. Nilai P ditantuan jo uji t basandiang (*P<0,05, **P<0,01 jo ***P<0,001). Garih mawakili pasien nan dicocokan (n = 6). FMO, cahayo minus ciek; LKM, intensitas pendar median.
Analisis labiah lanjuik mangungkapkan pabedaan signifikan lain antaro status fenotipik sel T nan disalasaikan tinggi. Memori nan diaktifkan (Gambar 1, G sampai I) jo efektor (Gambar 1, J jo K) pado tumor jauah labiah acok daripado asma (proporsi sel CD3 + T). Baitu juo, manganalisis fenotipe jo ekspresi panando aktivasi (CD25 jo CD137) jo panando kahabisan [protein kamatian sel nan diprogram 1 (PD1)] manunjuakan baso walaupun ciri-ciri metabolisme populasi-populasi ko babeda (Gambar S1, B sampai E) , Tapi indak ado pabedaan metabolisme nan signifikan nan diamati atau diamati sacaro konsisten. F sampai ambo). Hasia iko dikonfirmasi jo manggunoan metode pambalajaran masin untuak sacaro otomatis manatapkan fenotipe sel (21), nan labiah lanjuik mangungkapkan adonyo sajumlah gadang sel sumsum tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) pado asma pasien (Gambar S2A ). Di antaro sadoalah jinih sel nan diidentifikasi, populasi sel mieloid ko manunjuakan pangambilan glukosa jo aktivitas mitokondria tatinggi (Gambar S2, B sampai G). Hasia ko manyoroti pabedaan metabolisme nan kuek antaro babarapo jinih sel nan tadapek pado asma jo tumor pado pasien HGSC.
Tantangan utamo dalam mamahami ciri-ciri metabonomi TIL adolah kabutuhan untuak mangisolasi sampel sel T jo kamurnian, kualitas jo kuantitas nan cukuik dari tumor. Panalitian nan baru-baru ko manunjuakan baso caro panyortiran jo pangayaan manik-manik badasarkan sitometri aliran dapek manyababkan parubahan profil metabolit seluler (22-24). Untuak mangatasi masalah ko, kami mangoptimalkan metode pangayaan manik untuak mangisolasi jo mangisolasi TIL dari kanker ovarium manusia nan direseksi sacaro bedah sabalun dianalisa jo LC-MS / MS (caliak Bahan jo Metode; Gambar 2A). Untuak manilai dampak kasaluruhan dari protokol ko pado parubahan metabolit, kami mambandiangkan profil metabolit sel T nan diaktifkan dek donor sehat sasudah langkah pamisahan manik di ateh jo sel nan indak dipisahkan manik tapi tatap di ateh es. Analisis kontrol mutu ko manamuan baso ado korelasi tinggi antaro kaduo kondisi ko (r = 0,77), jo kamampuan pangulangan teknis dari kalompok 86 metabolit mampunyoi kamampuan pangulangan nan tinggi (Gambar 2B). Dek karano itu, caro-caro iko dapek malakuan analisis metabolit nan akurat pado sel nan manjalani pangayaan jinih sel, sahinggo manyadiokan platform resolusi tinggi patamo untuak maidentifikasi metabolit tatantu pado HGSC, sahinggo mamungkinkan urang untuak mandapekkan pamahaman nan labiah dalam tantang spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Gambar skematik pangayaan manik magnet. Sabalun dianalisa jo LC-MS/MS, sel-sel akan manjalani tigo putaran pangayaan manik magnet baturuik-turuik atau tatap di ateh es. (B) Pangaruah jinih pangayaan pado kalimpahan metabolit. Rato-rato tigo pangukuran untuak satiok jinih pangayaan ± SE. Garih abu-abu mawakili hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) dari pangukuran baulang nan ditunjuakan pado label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematik alur karajo analisis metabolit pasien. Asma atau tumor dikumpuakan dari pasien dan diawetkan dalam krio. Sabagian ketek dari satiok sampel dianalisa jo sitometri aliran, sadangkan sampel nan tasiso manjalani tigo putaran pangayaan untuak sel CD4+, CD8+ jo CD45-. Pacahan sel ko dianalisa jo manggunoan LC-MS/MS. (D) Peta paneh dari kalimpahan metabolit nan dibakukan. Dendrogram mawakili pangalompokan Ward dari jarak Euklid antar sampel. (E) Analisis komponen utamo (PCA) dari peta metabolit sampel, manunjuakan tigo replika dari satiok sampel, sampel dari pasien nan samo dihubuangkan jo garih. (F) PCA dari profil metabolit sampel nan dikondisikan pado pasien (yaitu, manggunoan redundansi parsial); jinih sampel dibatasi dek lambung cembung. PC1, komponen utamo 1; PC2, komponen utamo 2.
Salanjuiknyo, kami manerapkan metode pangayaan ko untuak manganalisis 99 metabolit pado fraksi sel-CD4 +, CD8 + jo CD45 pado asma jo tumor primer dari anam pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A jo Tabel S3 jo S4). Populasi nan diminati manyumbang 2% inggo 70% dari sampel gadang asli sel hiduik, jo proporsi sel sangaik bavariasi antaro pasien. Sasudah mamisahkan manik-manik, fraksi nan dikayai nan diminati (CD4+, CD8+ atau CD45-) manyumbang labiah dari 85% dari saluruah sel hiduik dalam sampel rato-rato. Metode pangayaan ko mamungkinkan kito untuak manganalisis populasi sel dari metabolisme jaringan tumor manusia, nan indak mungkin dilakukan dari sampel gadang. Manggunoan protokol iko, kami manantuan baso l-kinurenin jo adenosin, kaduo metabolit imunosupresif nan dicirikan baiak ko maningkek pado sel T tumor atau sel tumor (Gambar S3, B jo C). Dek karano itu, hasil iko manunjuakan kasatiaan jo kamampuan teknologi pamisahan sel jo spektrometri massa kito untuak mancari metabolit nan pantiang sacaro biologis pado jaringan pasien.
Analisis kami juo mangungkapkan pamisahan metabolisme nan kuek dari jinih sel di dalam jo antaro pasien (Gambar 2D jo Gambar S4A). Sacaro khusus, dibandiangkan jo pasien lain, pasien 70 manunjuakan ciri metabolisme nan babeda (Gambar 2E jo Gambar S4B), nan manunjuakan baso mungkin ado heterogenitas metabolisme nan substansial antaro pasien. Paralu diparatian baso dibandiangkan jo pasien lain (1,2 inggo 2 liter; Tabel S1), jumlah total asma nan dikumpuakan pado pasien 70 (80 ml) labiah ketek. Kontrol heterogenitas antar pasien salamo analisis komponen utamo (misalnyo, manggunoan analisis redundansi parsial) manunjuakan parubahan nan konsisten antaro jinih sel, jo jinih sel jo/atau lingkuangan mikro jaleh diagregasi sasuai jo profil metabolit (Gambar 2F ). Analisis metabolit tungga manakankan efek-efek iko jo mangungkapkan pabedaan nan signifikan antaro jinih sel jo lingkuangan mikro. Paralu diparatian baso pabedaan nan paliang ekstrim nan diamati adolah MNA, nan biasonyo dikayai jo sel CD45- jo pado sel CD4+ jo CD8+ nan manyusup ka tumor (Gambar 3A). Untuak sel CD4 +, efek iko paliang jaleh, dan MNA pado sel CD8 + juo tampaknyo sangaik dipangaruahi dek lingkuangan. Namun, hal iko indak pantiang, karano hanyo tigo dari anam pasien nan dapek dievaluasi untuak skor CD8+ tumor. Salain MNA, pado jinih sel nan babeda pado asma jo tumor, metabolit lain nan kurang dicirikan pado TIL juo kayo sacaro babeda (Gambar S3 jo S4). Dek karano itu, data ko mangungkapkan sakumpulan metabolit imunomodulasi nan manjanjikan untuak panalitian labiah lanjuik.
(A) Kanduangan MNA nan dinormalkan pado sel CD4+, CD8+ jo CD45- dari asma jo tumor. Plot kotak manunjuakan median (garih), rentang antarkuartil (engsel bingkai) jo rentang data, sampai 1,5 kali rentang antarkuartil (kumih bingkai). Sarupo nan dijalehan dalam Bahan jo Metode Pasien, gunoan nilai limma pasien untuak manantuan nilai P (*P<0,05 jo **P<0,01). (B) Gambar skema dari metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, ribosa nikotinamida; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (warna hijau): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuin; NAMPT, pamindahan nikotinamida fosforibosil; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono nukleotida adenilat pamindahan; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE dari scRNA-seq dari asma (abu-abu) jo tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT pado populasi sel nan babeda nan diidentifikasi manggunoan scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT jo AOX1 pado SK-OV-3, ginjal embrio manusia (HEK) 293T, sel T jo sel T nan dirawat jo MNA. Ungkapan nan dilipek ditunjuakan relatif pado SK-OV-3. Pola ekspresi jo SEM ditunjuakan (n = 6 donor sehat). Nilai Ct labiah dari 35 dianggap indak dapek dideteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 jo SLC22A2 pado SK-OV-3, HEK293T, sel T jo sel T nan dirawat jo MNA 8mM. Ungkapan nan dilipek ditunjuakan relatif pado SK-OV-3. Pola ekspresi jo SEM ditunjuakan (n = 6 donor sehat). Nilai Ct labiah dari 35 dianggap indak dapek dideteksi (UD). (G) Kanduangan MNA sel pado sel T donor sehat nan diaktifkan sasudah 72 jam inkubasi jo MNA. Pola ekspresi jo SEM ditunjuakan (n = 4 donor sehat).
MNA dihasiakan jo mamindahan gugus metil dari S-adenosil-1-metionin (SAM) ka nikotinamida (NA) dek nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT diekspresikan balabiah-labiah pado babagai kanker manusia jo takaik jo proliferasi, invasi jo metastasis (25-27). Untuak labiah mamahami sumber MNA pado sel T pado TME, kami manggunoan scRNA-seq untuak mancariakan ekspresi NNMT di saluruah jinih sel pado asma jo tumor tigo pasien HGSC (Tabel S5). Analisis labiah kurang 6.500 sel manunjuakan baso pado lingkuangan asma jo tumor, ekspresi NNMT dibatasi pado populasi fibroblas jo sel tumor nan diduga (Gambar 3, C jo D). Paralu diparatian baso indak ado ekspresi NNMT nan jaleh pado populasi apopun nan mangekspresikan PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D jo Gambar S5A), nan manunjuakan baso MNA nan tadeteksi pado spektrum metabolit alah dimasuakkan ka dalam sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) maubah MNA manjadi 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atau 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Gambar 3B) juo dibatasi pado populasi fibroblas nan mangekspresikan COL1A1 (Gambar S5A), nan basamo-samo manunjuakan baso sel T kurang kamampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen nan takaik jo MNA ko diverifikasi manggunoan kumpulan data sel mandiri kaduo dari asma dari pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Salain itu, analisis reaksi barantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor sehat nan dirawat jo MNA manunjuakan baso dibandiangkan jo sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT atau AOX1 ampia indak diekspresikan (Gambar 3E). Hasia nan indak didugo ko manunjuakan baso MNA dapek disekresikan dari fibroblas atau tumor ka sel T nan badakek-an pado TME.
Walaupun calon tamasuak kaluarga pambaok kation organik 1 sampai 3 (OCT1, OCT2 jo OCT3) nan dikodekan dek kaluarga pambaok laruik 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 jo SLC22A3), potensi pambaok MNA masih alun ditantuan (28) . QPCR mRNA dari sel T donor nan sehat manunjuakan tingkek ekspresi SLC22A1 nan randah tapi tingkek SLC22A2 nan indak dapek dideteksi, nan managakan baso hal iko alah dilaporkan sabalunnyo dalam literatur (Gambar 3F) (29). Sabaliaknyo, garih sel tumor ovarium SK-OV-3 manyatoan tingkek tinggi dari kaduo transporter (Gambar 3F).
Untuak mauji kamungkinan sel T mampunyoi kamampuan untuak manyerap MNA asing, sel T donor nan sehat dibudidayakan salamo 72 jam jo adonyo konsentrasi MNA nan babeda. Dalam indak adonyo MNA eksogen, kanduangan seluler MNA indak dapek dideteksi (Gambar 3G). Namun, sel T nan diaktifkan nan dirawat jo MNA eksogen manunjuakan paningkekan kanduangan MNA nan tagantuang pado dosis dalam sel, sampai 6 mM MNA (Gambar 3G). Hasia ko manunjuakan baso walaupun tingkek ekspresi transporter randah jo kurangnyo enzim utamo nan batangguang jawab pado metabolisme MNA intraseluler, TIL masih dapek maambiak MNA.
Spektrum metabolit pado sel T pasien jo pacobaan panyarapan MNA in vitro maningkekan kamungkinan fibroblas nan takaik jo kanker (CAF) mangaluaan MNA jo sel tumor dapek maatur fenotipe jo fungsi TIL. Untuak manantuan efek MNA pado sel T, sel T donor nan sehat diaktifkan sacaro vitro pado ado atau indaknyo MNA, jo proliferasi jo produksi sitokinnyo dievaluasi. Sasudah 7 hari manambahkan MNA pado dosis tatinggi, jumlah panggandaan populasi sadang bakurang, samantaro kekuatan dipaliharo pado sadoalah dosis (Gambar 4A). Salain itu, ubek MNA eksogen maakibaikan paningkekan proporsi sel T CD4 + jo CD8 + nan mangekspresikan faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sabaliaknyo, produksi intraseluler IFN-γ bakurang sacaro signifikan pado sel CD4 + T, tapi indak pado sel CD8 + T, dan indak ado parubahan nan signifikan pado interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C jo D). Dek karano itu, uji imunosorben takaik jo enzim (ELISA) dari supernatan dari kultur sel T nan dirawat jo MNA ko manunjuakan paningkekan TNFα nan signifikan, panurunan IFN-γ, jo indak ado parubahan IL-2 (Gambar 4, E sampai G). . Panurunan IFN-γ manunjuakan baso MNA mungkin baparan dalam mangambati aktivitas anti-tumor sel T. Untuak mansimulasikan efek MNA pado sitotoksisitas nan dimediasi dek sel T, sel reseptor antigen kimerik T (FRα-CAR-T) nan manargetakan reseptor folat α jo CAR-T (GFP) nan diatur dek sel protein neon hijau (GFP) -CAR-T) dihasiakan dek sel donor nan sehat darah tepi mononuclear PBMC. Sel CAR-T dibudidayakan salamo 24 jam jo adonyo MNA, dan kamudian dibudidayakan basamo jo sel tumor ovarium SK-OV-3 manusia nan mangekspresikan reseptor folat α pado rasio efektor jo sasaran 10:1. Pangobatan MNA maakibaikan panurunan nan signifikan pado aktivitas pambunuahan sel FRα-CAR-T, nan sarupo jo sel FRα-CAR-T nan dirawat jo adenosin (Gambar 4H).
(A) Total jumlah sel layak jo panggandaan populasi (PD) langsuang dari kultur pado hari 7. Grafik batang mawakili rata-rata + SEM dari anam donor nan sehat. Mawakili data dari sakurang-kurangnyo n = 3 eksperimen mandiri. (B sampai D) CD3/CD28 jo IL-2 digunoan untuak maaktifkan sel T pado konsentrasi MNA masiang-masiang salamo 7 hari. Sabalun dianalisa, sel-sel dirangsang jo PMA/ionomisin jo GolgiStop salamo 4 jam. Ekspresi TNFα (B) pado sel T. Contoh gambar (kiri) jo data tabular (kanan) ekspresi TNFα pado sel hiduik. Ekspresi IFN-γ (C) jo IL-2 (D) pado sel T. Ekspresi sitokin diukua jo sitometri aliran. Grafik batang mawakili rato-rato (n = 6 donatur sehat) + SEM. Gunoan analisis varians satu arah jo pangukuran baulang (*P<0,05 jo **P<0,01) untuak manantuan nilai P. Mawakili data dari sakurang-kurangnyo n = 3 eksperimen mandiri. (E sampai G) CD3/CD28 jo IL-2 digunoan untuak maaktifkan sel T pado konsentrasi MNA masiang-masiang salamo 7 hari. Media dikumpuakan sabalun jo sasudah 4 jam rangsangan PMA/ionomisin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) jo IL-2 (G) diukua jo caro ELISA. Grafik batang mawakili rato-rato (n = 5 donor nan sehat) + SEM. Nilai P ditantuan jo manggunoan analisis varians satu arah jo pangukuran baulang (*P<0,05). Garih titiak-titik manunjuakan bateh deteksi dari deteksi. (H) Uji lisi sel. Sel FRα-CAR-T atau GFP-CAR-T disasuaian jo adenosin (250μM) atau MNA (10 mM) salamo 24 jam, atau dibiakan indak dirawat (Ctrl). Persentase pambunuahan sel SK-OV-3 diukua. Nilai P ditantuan jo uji t Welch (*P<0,5 jo **P<0,01).
Untuak mandapekkan pamahaman mekanistik tantang pangaturan ekspresi TNFα nan tagantuang pado MNA, parubahan mRNA TNFα dari sel T nan dirawat jo MNA dievaluasi (Gambar 5A). Sel T donor nan sehat nan dirawat jo MNA manunjuakan paningkekan duo kali lipek pado tingkek transkripsi TNFα, nan manunjuakan baso MNA tagantuang pado pangaturan transkripsi TNFα. Untuak manyalidiak kamungkinan mekanisme pangaturan ko, duo faktor transkripsi nan dikatahui nan mangatur TNFα, yaitu faktor inti sel T nan diaktifkan (NFAT) jo protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi sabagai tanggapan taradok pangikatan MNA pado promotor TNFα proksimal ( 30 ). Promotor TNFα manganduang 6 tampek pangikek NFAT nan diidentifikasi jo 2 tampek pangikek Sp1, nan batumpuak pado satu tampek [-55 pasangan basa (bp) dari 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) manunjuakan baso katiko dirawat jo MNA, pangikatan Sp1 pado promotor TNFα maningkek tigo kali lipek. Panggabungan NFAT juo maningkek dan mandakek ka pantiangnyo (Gambar 5B). Data ko manunjuakan baso MNA maatur ekspresi TNFα malalui transkripsi Sp1, jo sacaro labiah saketek ekspresi NFAT.
(A) Dibandiangkan jo sel T nan dibudidayakan tanpa MNA, parubahan lipatan ekspresi TNFα pado sel T nan dirawat jo MNA. Pola ekspresi jo SEM ditunjuakan (n = 5 donor sehat). Mawakili data dari sakurang-kurangnyo n = 3 eksperimen mandiri. (B) Promotor TNFα sel T nan dirawat jo atau tanpa MNA 8 mM sasudah NFAT jo Sp1 digabuangan jo rangsangan (Ctrl) jo PMA/ionomisin salamo 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) jo H3 digunoan sabagai kontrol negatif jo positif untuak imunopresipitasi, masiang-masiang. Kuantifikasi ChIP manunjuakan baso pangikatan Sp1 jo NFAT pado promotor TNFα pado sel nan dirawat jo MNA maningkek babarapo kali dibandiangkan jo kontrol. Mawakili data dari sakurang-kurangnyo n = 3 eksperimen mandiri. Nilai P ditantuan jo babarapo uji t (*** P <0,01). (C) Dibandiangkan jo asma HGSC, sel T (non-sitotoksik) manunjuakan paningkekan ekspresi TNF pado tumor. Warna-warna tu mawakili pasien nan babeda. Sel-sel nan ditampilkan alah diambiak sampel sacaro acak sampai 300 dan digoyang-goyang untuak mambatasi gambar nan balabiah (** Padj = 0,0076). (D) Model MNA nan diusulkan untuak kanker ovarium. MNA diproduksi pado sel tumor jo fibroblas pado TME dan diambiak dek sel T. MNA maningkekan pangikatan Sp1 pado promotor TNFα, nan manyababkan paningkekan transkripsi TNFα jo produksi sitokin TNFα. MNA juo manyababkan panurunan IFN-γ. Pangambatan fungsi sel T manyababkan kamampuan mambunuah bakurang jo patumbuahan tumor nan mampacapek.
Manuruik laporan, TNFα mampunyoi efek anti-tumor jo anti-tumor nan tagantuang pado muko jo balakang, tapi mampunyoi peran nan tanamo dalam mandorong patumbuahan jo metastasis kanker ovarium (31-33). Manuruik laporan, konsentrasi TNFα pado asma jo jaringan tumor pado pasien kanker ovarium labiah tinggi daripado jaringan jinak (34-36). Dalam hal mekanisme, TNFα dapek maatur aktivasi, fungsi jo proliferasi sel darah putiah, sarato maubah fenotipe sel kanker (37, 38). Konsisten jo panamuan iko, analisis ekspresi gen diferensial manunjuakan baso TNF sacaro signifikan diatur ka ateh pado sel T pado jaringan tumor dibandiangkan jo asma (Gambar 5C). Paningkekan ekspresi TNF hanyo tanyato pado populasi sel T jo fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Singkatnyo, data ko mandukuang pandangan baso MNA mampunyoi efek imunosupresif ganda jo mampromosikan tumor pado HGSC.
Palabelan neon badasarkan sitometri aliran alah manjadi metode utamo untuak mampalajari metabolisme TIL. Panalitian ko manunjuakan baso dibandiangkan jo limfosit darah tepi atau sel T dari organ limfoid sekunder, TIL tikus jo manusia mampunyoi kecenderungan nan labiah tinggi untuak mangambiak glukosa (4, 39) jo kahilangan fungsi mitokondria sacaro batahap (19, 40). Walaupun kami alah mangamati hasil nan sarupo dalam panalitian ko, pakambangan kunci adolah mambandiangkan metabolisme sel tumor jo TIL dari jaringan tumor nan samo nan direseksi. Sasuai jo babarapo laporan sabalunnyo ko, sel tumor (CD45-EpCAM +) dari asma jo tumor mampunyoi pangambilan glukosa nan labiah tinggi daripado sel T CD8 + jo CD4 +, nan mandukuang baso pangambilan glukosa tinggi sel tumor dapek dibandiangkan jo sel T. Konsep persaingan sel T nan ado. SAMA. Namun, aktivitas mitokondria sel tumor labiah tinggi daripado sel CD8 + T, tapi aktivitas mitokondria sarupo jo sel CD4 + T. Hasia ko mampakuek tema nan muncua baso metabolisme oksidatif pantiang untuak sel tumor (41, 42). Mareka juo manyarankan baso sel CD8 + T mungkin labiah rawan jo disfungsi oksidatif daripado sel CD4 + T, atau baso sel CD4 + T mungkin manggunoan sumber karbon salain glukosa untuak mampatahankan aktivitas mitokondria (43, 44). Paralu dicaliak baso kami mangamati indak ado pabedaan dalam pangambilan glukosa atau aktivitas mitokondria antaro efektor CD4 + T, memori efektor T jo sel memori pusat T pado asma. Baitu juo, kaadaan diferensiasi sel T CD8 + pado tumor indak ado hubungannyo jo parubahan pangambilan glukosa, nan manyoroti pabedaan nan signifikan antaro sel T nan dibudidayakan sacaro vitro jo TIL manusia sacaro vivo (22). Pangamatan iko juo dikonfirmasi jo panggunoan alokasi populasi sel otomatis nan indak bias, nan labiah lanjuik mangungkapkan baso sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + jo pangambilan glukosa jo aktivitas mitokondria nan labiah tinggi daripado sel tumor nan lazim tapi mampunyoi populasi sel aktif Metabolik. Populasi ko mungkin mawakili subpopulasi nan diduga dari sel panakan mieloid atau sel dendritik plasmasitoid nan diidentifikasi dalam analisis scRNA-seq. Walaupun kaduonyo alah dilaporkan pado tumor ovarium manusia [45] , inyo masih paralu Karajo labiah lanjuik adolah untuak manggambarkan subpopulasi mieloid ko.
Walaupun metode babasis sitometri aliran dapek manjalehan pabedaan umum glukosa jo metabolisme oksidatif antaro jinih sel, metabolit nan tapek nan dihasiakan dek glukosa atau sumber karbon lain untuak metabolisme mitokondria pado TME alun ditantuan. Manetapkan ado atau indaknyo metabolit pado subset TIL tatantu mamaralukan pamurnian populasi sel dari jaringan nan dieksisi. Dek karano itu, metode pangayaan sel kami nan digabuangan jo spektrometri massa dapek mambarikan wawasan tantang metabolit nan dikayai sacaro babeda dalam sel T jo populasi sel tumor dalam mancocokan sampel pasien. Walaupun metode ko mampunyoi kauntuangan daripado panyortiran sel nan diaktifkan jo fluoresensi, pustaka metabolit tatantu dapek tapangaruah dek stabilitas nan melekat jo/atau tingkat omset nan capek (22). Namun baitu, metode kami dapek maidentifikasi duo metabolit imunosupresif nan diakui, adenosin jo kinurenin, karano inyo sangaik babeda antaro jinih sampel.
Analisis metabonomi kami tantang tumor jo subtipe TIL mambarikan labiah banyak wawasan tantang peran metabolit pado TME ovarium. Partamo, manggunoan sitometri aliran, kami manantuan baso indak ado pabedaan aktivitas mitokondria antaro tumor jo sel CD4 + T. Namun, analisis LC-MS/MS mangungkapkan parubahan nan signifikan dalam kalimpahan metabolit di antaro populasi ko, nan manunjuakan baso kasimpulan tantang metabolisme TIL jo aktivitas metabolismenyo sacaro kasaluruahan mamaralukan panafsiran nan hati-hati. Nan kaduo, MNA adolah metabolit jo pabedaan nan paliang gadang antaro sel-CD45 jo sel T pado asma, bukan tumor. Dek karano itu, kompartementalisasi jo lokasi tumor mungkin mampunyoi efek nan babeda pado metabolisme TIL, nan manyoroti kamungkinan heterogenitas pado lingkuangan mikro tatantu. Katigo, ekspresi enzim panghasil MNA NNMT tarutamo tabateh pado CAF, nan marupoan sel tumor sacaro labiah saketek, tapi kadar MNA nan dapek dideteksi diamati pado sel T nan barasa dari tumor. Ekspresi balabiah NNMT pado CAF ovarium mampunyoi efek nan dikatahui mandorong kanker, sabagian dek promosi metabolisme CAF, invasi tumor jo metastasis (27). Walaupun tingkek TIL sacaro kasaluruahan sadang, ekspresi NNMT pado CAF takaik arek jo subtipe mesenkim Atlas Genom Kanker (TCGA), nan takaik jo prognosis nan buruak (27, 46, 47). Nan tarakhia, ekspresi enzim AOX1 nan batangguang jawab pado degradasi MNA juo tabateh pado populasi CAF, nan manunjuakan baso sel T kurang kamampuan untuak mametabolisme MNA. Hasia ko mandukuang gagasan baso walaupun karajo labiah lanjuik diparaluan untuak mamverifikasi panamuan ko, tingkek MNA nan tinggi pado sel T mungkin manunjuakan adonyo lingkuangan mikro CAF nan imunosupresif.
Maingek tingkek ekspresi transporter MNA nan randah jo tingkek protein kunci nan talibaik dalam metabolisme MNA nan indak dapek dideteksi, adonyo MNA pado sel T indak didugo. Baik NNMT maupun AOX1 indak dapek dideteksi jo analisis scRNA-seq jo qPCR nan ditargetkan dari duo kohort mandiri. Hasia ko manunjuakan baso MNA indak disintesis dek sel T, tapi diserap dari TME sakitarnyo. Pacobaan in vitro manunjuakan baso sel T cenderung mangumpuakan MNA eksogen.
Panalitian in vitro kami manunjuakan baso MNA eksogen manginduksi ekspresi TNFα pado sel T jo maningkekan pangikatan Sp1 pado promotor TNFα. Walaupun TNFα mampunyoi fungsi anti-tumor jo anti-tumor, pado kanker ovarium, TNFα dapek mandorong patumbuahan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα pado kultur sel tumor ovarium atau panghapusan sinyal TNFα pado model tikuih dapek maningkekan produksi sitokin radang nan dimediasi TNFα jo mangambati patumbuahan tumor (32, 35). Dek karano itu, dalam hal iko, MNA nan barasa dari TME dapek batindak sabagai metabolit pro-inflamasi malalui mekanisme nan tagantuang pado TNFα malalui loop autokrin, sahinggo mandorong tajadinyo jo panyabaran kanker ovarium (31). Badasakan kamungkinan iko, blokade TNFα sadang dikaji sabagai agen terapi nan bapotensi untuak kanker ovarium (37, 48, 49). Salain itu, MNA mangganggu sitotoksisitas sel CAR-T pado sel tumor ovarium, mambarikan bukti labiah lanjuik untuak panakanan imun nan dimediasi MNA. Sacaro kolektif, hasil iko manyarankan model di mano tumor jo sel CAF mangaluaan MNA ka dalam TME ekstraseluler. Malalui (i) rangsangan patumbuahan kanker ovarium nan diinduksi dek TNF jo (ii) panghambatan aktivitas sitotoksik sel T nan diinduksi dek MNA, hal iko mungkin mampunyoi efek tumor ganda (Gambar 5D).
Kasimpulannyo, jo manerapkan kombinasi pangayaan sel nan capek, urutan sel tungga jo profil metabolisme, panalitian ko mangungkapkan pabedaan imunometabolomik nan gadang antaro tumor jo sel asma pado pasien HGSC. Analisis komprehensif ko manunjuakan baso ado pabedaan dalam pangambilan glukosa jo aktivitas mitokondria antaro sel T, jo maidentifikasi MNA sabagai metabolit pangaturan imun otonom non-sel. Data ko mampunyoi dampak pado baa TME mampangaruahi metabolisme sel T pado kanker manusia. Walaupun pasaingan langsuang untuak nutrisi antaro sel T jo sel kanker alah dilaporkan, metabolit dapek juo batindak sabagai pangatur indak langsuang untuak mandorong kamajuan tumor jo kamungkinan manakan tanggapan imun endogen. Panjalehan labiah lanjuik tantang peran fungsional metabolit pangaturan ko dapek mambukak strategi alternatif untuak maningkekan tanggapan imun anti-tumor.
Spesimen pasien jo data klinis didapek malalui panyimpanan jaringan tumor kanker SM nan disertifikasi dek Jaringan Panyimpanan Jaringan Kanada. Manuruik protokol nan disetujui dek Komite Etika Panalitian Kanker SM jo Universitas Columbia (H07-00463), sadoalah spesimen jo data klinis pasien mandapek persetujuan tatulih nan diagiah informasi atau sacaro resmi manangguang persetujuannyo. Sampelnyo disimpan di BioBank nan alah disertifikasi (BRC-00290). Karakteristik pasien nan rinci ditunjuakan pado Tabel S1 jo S5. Untuak kriopreservasi, pisau bedah digunoan untuak mangurai sampel tumor pasien sacaro mekanis dan kamudian mandorongnyo malalui saringan 100 mikron untuak mandapekkan suspensi sel tungga. Asma pasien disentrifugasi pado 1500 rpm salamo 10 minik pado suhu 4°C untuak pelet sel-sel jo mangaluaan supernatan. Sel-sel nan didapek dari tumor jo asma diawetan dalam kriopreservasi dalam 50% serum AB manusia nan indak diaktifkan jo paneh (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) jo 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tungga nan diawetan ko dicairkan jo digunoan untuak metabolomik jo panantuan metabolit nan dijalehan di bawah ko.
Media langkok tadiri dari 0,22 μm nan disaring 50:50 nan ditambahi jo RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Ilmiah Termo Fisher) ditambahi jo 10% serum AB manusia nan diinaktifkan jo paneh (Sigma-Aldrich), Hepes 12,5 mM (Ilmiah Nelayan Termo), 2 mM l-glutamin (Ilmiah Nelayan Termo). Larutan streptomisin (PenStrep) jo 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) ditambahi jo Hepes 20 mM (Ilmiah Termo Nelayan) jo l-glutamin 2 mM (Ilmiah Termo Nelayan). Penyangga pewarnaan sitometer aliran tadiri dari 0,22μm garam penyangga fosfat nan disaring (PBS; Invitrogen) nan ditambahi jo 3% serum manusia AB nan indak diaktifkan jo paneh (Sigma). Penyangga pangayaan sel tadiri dari PBS nan disaring 0,22μm jo ditambahi jo serum AB manusia nan indak diaktifkan jo paneh 0,5% (Sigma-Aldrich).
Dalam medium langkok suhu 37°C, sel-sel diwarnai jo DR MT 10 nM jo 2-NBDG 100 μM salamo 30 minik. Salanjuiknyo, sel-sel diwarnai jo pewarna daya tahan eF506 pado suhu 4°C salamo 15 minik. Suspensi ulang sel-sel dalam Blok FC (eBiosains) jo Penyangga Noda Brilian (BD Biosains), encerkan dalam penyangga pewarnaan sitometer aliran (manuruik instruksi pambueknyo), jo inkubasi salamo 10 minik pado suhu ruangan. Pewarnaan sel jo saparangkat antibodi (Tabel S2) dalam penyangga pewarnaan sitometri aliran pado suhu 4°C salamo 20 minik. Disuspensi baliak sel-sel dalam penyangga pewarnaan sitometri aliran (konfigurasi Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sabalun dianalisa. Gunoan SpectroFlo jo FlowJo V10 untuak manganalisis data hitungan sel, dan gunoan GraphPad Prism 8 untuak mambuek data. Intensitas fluoresensi median (LKM) 2-NBDG jo MT DR dinormalisasi log, dan kamudian uji t basandiang digunoan untuak analisis statistik untuak manjalehkan pasien nan cocok. Hapuih sadoalah populasi nan kurang dari 40 kajadian dari analisis; masuakkan nilai LKM 1 untuak nilai negatif apo sajo sabalun malakukan analisis statistik jo visualisasi data.
Untuak malangkapi strategi gerbang manual dari panel proses di ateh, kami manggunoan anotasi panuah dek pohon pambatasan bantuak (FAUST) (21) untuak sacaro otomatis manatapkan sel ka populasi sasudah mailangkan sel mati di FlowJo. Kami mangalola kaluanyo sacaro manual untuak manggabuangkan populasi nan tampaknyo salah dialokasikan (manggabuangan PD1+ jo sel-sel tumor PD1) jo populasi nan ditahan. Satiok sampel manganduang rato-rato labiah dari 2% sel, untuak sabanyak 11 populasi.
Sentrifugasi kapadekan gradien fikol digunoan untuak mamisahkan PBMC dari produk pamisahan leukosit (Teknologi SEL STEMCELL). Sel CD8 + T diisolasi dari PBMC manggunoan CD8 MicroBeads (Miltenyi) dan diluaskan dalam media langkok manggunoan TransAct (Miltenyi) salamo 2 minggu manuruik instruksi pambueknyo. Sel-sel iko dibiakan tagak salamo 5 hari dalam medium langkok nan manganduang IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), lalu dirangsang baliak jo TransAct. Pado hari ka-7, manuruik instruksi pambueknyo, Manik-manik Mikro CD45 manusia (Miltenyi) digunoan untuak mampakayo sel dalam tigo putaran baturuik-turuik. Sel-sel dialikuot untuak analisis sitometri aliran (sarupo nan dijalehan di ateh), jo sajuta sel dialikuot tigo kali untuak analisis LC-MS/MS. Sampel diproses jo LC-MS/MS sarupo nan dijalehan di bawah ko. Kami mampakiroan nilai metabolit nan hilang jo jumlah ion 1.000. Satiok sampel dinormalisasi jo jumlah ion total (TIC), diubah sacaro logaritmik dan dinormalisasi sacaro otomatis dalam MetaboAnalystR sabalun dianalisa.
Suspensi sel tungga dari satiok pasien dicairkan jo disaring malalui saringan 40 μm manjadi medium langkok (sarupo nan dijalehan di ateh). Manuruik protokol pambuek, tigo putaran pamiliahan positif baturuik-turuik jo pamisahan manik-manik magnet manggunoan MicroBeads (Miltenyi) digunoan untuak mampakayo sampel untuak sel CD8+, CD4+ jo CD45- (di ateh es). Singkeknyo, sel-sel tu disuspensikan baliak dalam penyangga pangayaan sel (sarupo nan dijalehan di ateh) dan dietong. Sel-sel diinkubasi jo manik-manik CD8 manusia, manik-manik CD4 manusia atau manik-manik CD45 manusia (Miltenyi) pado suhu 4°C salamo 15 minik, dan kamudian dibasuah jo penyangga pangayaan sel. Sampel dilewakan malalui kolom LS (Miltenyi), dan pecahan positif jo negatif dikumpuakan. Untuak mangurangi durasi jo mamaksimalkan langkah pamulihan sel, fraksi-CD8 kamudian digunoan untuak putaran kaduo pangayaan CD4+, jo fraksi-CD4 digunoan untuak pangayaan CD45 barikuiknyo. Jago larutan di ateh es sapanjang proses pamisahan.
Untuak manyiapkan sampel untuak analisis metabolit, sel-sel dibasuah sakali jo larutan garam nan dingin sarupo es, jo 1 ml metanol 80% ditambahkan ka satiok sampel, kamudian diputar-putar jo dibekukan sacaro capek dalam nitrogen cair. Sampel diagiah tigo siklus beku-cair jo disentrifugasi pado 14.000 rpm salamo 15 minik pado suhu 4°C. Tanah nan manganduang metabolit diuapkan sampai kariang. Metabolit dilaruikkan baliak dalam 50 μl asam formik 0,03%, diputar untuak bacampua, dan kamudian disentrifugasi untuak maapuih puing-puing.
Ekstrak metabolit sarupo nan dijalehan di ateh. Pindahan supernatan ka botol kromatografi cairan nan bakinerja tinggi untuak panalitian metabolomik. Gunoan protokol ubek acak untuak maubek satiok sampel jo jumlah sel nan sarupo untuak mancagah efek batch. Kami malakukan panilaian kualitatif pado metabolit global nan sabalunnyo dipublikasikan pado spektrometer massa kuadrupol tigo (50). Analisis kromatografi jo integrasi daerah puncak dilakukan jo manggunoan parangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Biosistem Terapan SCIEX).
Hitungan ion 1000 digunoan untuak mampakiroan nilai metabolit nan hilang, jo TIC dari satiok sampel digunoan untuak mahituang luas puncak nan dinormalisasi dari satiok metabolit nan tadeteksi untuak mangoreksi parubahan nan diperkenalkan dek analisis instrumental dari pamrosesan sampel. Sasudah TIC dinormalisasi, MetaboAnalisR (51) (parameter bawaan) digunoan untuak konversi logaritmik jo skala garih norma otomatis. Kami manggunoan PCA jo paket R vegan untuak malakuan analisis eksplorasi pabedaan metabolom antaro jinih sampel, jo manggunoan analisis redundansi parsial untuak manganalisis pasien. Gunoan metode Ward untuak mambangun dendrogram peta paneh untuak mangalompokkan jarak Euclid antar sampel. Kami manggunoan limma (52) pado kalimpahan metabolit nan dibakukan untuak maidentifikasi metabolit nan malimpah sacaro babeda di saluruah jinih sel jo lingkuangan mikro. Untuak mampamudah panjalehan, kami manggunoan parameter rata-rata kalompok untuak manantukan model, jo maanggap jinih sel dalam lingkuangan mikro sabagai satiok kalompok (n = 6 kalompok); untuak uji signifikansi, kami malakuan tigo pangukuran baulang untuak satiok metabolit Untuak mahindari replikasi palsu, pasien dimasuakkan sabagai rintangan dalam desain limma. Untuak mamareso pabedaan metabolit antaro pasien nan babeda, kami manyasuaian model limma tamasuak pasien jo caro nan tatap. Kami malaporkan signifikansi kontras nan alah ditantuan sabalunnyo antaro jinih sel jo lingkuangan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Sasudah pangayaan kekuatan manggunoan Kit Panghapusan Sel Mati Miltenyi (>80% daya tahan), urutan transkriptom sel tungga dilakukan pado total sampel asma jo tumor beku hiduik manggunoan protokol ekspresi gen 5′ 10x. Limo kasus jo tumor jo asma nan cocok dianalisa, walaupun daya tahan nan randah dari ciek sampel tumor managah dimasuakkannyo. Untuak mancapai babarapo pamiliahan pasien, kami manggabuangkan sampel satiok pasien di jalur kontroler kromium 10x, jo manganalisis tampek asma jo tumor sacaro tapisah. Sasudah diuruik [Ujuang nan basandiang (PE) 28×98 bp, genom Quebec; rato-rato 73.488 jo 41.378 pambacoan per sel untuak tumor jo asma masiang-masiang]], kami manggunoan CellSNP jo Vireo (badasarkan CellSNP sabagai SNP manusia umum (VCF) nan disadiokan dek GRCh38 ditugaskan identitas donor. (IBS), indak tamasuak sel-sel nan indak ditugaskan jo sel-sel nan diidentifikasi sabagai dupleks jo donor nan cocok antaro asma jo sampel tumor (54 Badasarkan tugas ko, kami mampatahankan tigo kasus jo representasi sel nan malimpah pado tumor jo asma untuak analisis hilir (paktor scCoran ko) dihasilkan 6975 sel (2792 dan 4183 sel dari tumor dan asma, masiang-masiang) untuak dianalisa Kami manggunokan igraph (57) Pengelompokan Louvain dari jaringan tetangga terdakek nan dibagikan (SNN) badasarkan jarak gen Jaccard ka sel-sel nan dikelompokkan jo ekspresi annoker sacaro manual. dan divisualkan jo t-SNE sel T sitotoksik ditantuan dek ekspresi CD8A jo GZMA, indak tamasuak subkluster jo ekspresi protein ribosom nan randah (16), tamasuak penyematan t-SNE mareka, dapek mangandalikan tumpang tindih ekspresi sel imun.
PBMC dipisahkan dari produk pamisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) jo sentrifugasi kapadekan gradien Ficoll. Sel CD3 + diisolasi dari PBMC manggunoan manik-manik CD3 (Miltenyi). Ado atau indaknyo MNA, sel CD3+ diaktifkan jo CD3 nan takaik jo lempeng (5μg/ml), CD28 nan laruik (3μg/ml) jo IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Pado hari tarakhia ekspansi, kalayakan hiduik (Pewarna Kelangsungan Hidup nan Dapek Diperbaiki eFluor450, eBiosains) jo proliferasi (123hitungan eManik-manik, Ilmiah Nelayan Termo) dievaluasi jo sitometri aliran. Manilai fungsi efektor jo marangsang sel jo PMA (20 ng/ml) jo ionomisin (1 μg/ml) jo GolgiStop salamo 4 jam, jo ​​mamantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), CD4-AF700 (RPA-T4). (Mab11, BD). Marangsang sel qPCR jo ChIP jo PMA (20 ng/ml) jo ionomisin (1μg/ml) salamo 4 jam. Supernatan ELISA dikumpuakan sabalun jo sasudah rangsangan jo PMA (20 ng/ml) jo ionomisin (1 μg/ml) salamo 4 jam.
Ikuik protokol pambuek untuak mangisolasi RNA manggunoan RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gunokan alat pamacah QIA (QIAGEN) untuak mahomogenkan sampel. Gunoan kit RNA untuak cDNA bakapasitas tinggi (Ilmiah Termo Fisher) untuak mansintesis DNA saling melengkapi (cDNA). Gunoan Campuaan Induk Lanjuik TaqMan Rapid (Thermo Fisher Scientific) untuak mangukua ekspresi gen (manuruik protokol pambueknyo) jo probe barikuik: gliseraldehida-3-fosfat dari hidrogen (GAPDH)] jo Hs1010726-m1 (SLC22A2). Sampel dijalankan pado sistem PCR wakatu nyato StepOnePlus (Biosistem Terapan) (Biosistem Terapan) pado pelat reaksi optik capek 96 sumur MicroAmp (Biosistem Terapan) jo film optik MicroAmp. Satiok nilai Ct nan malabihi 35 dianggap barado di ateh ambang batas deteksi dan ditandoi sabagai indak dapek dideteksi.
Lakukan ChIP sarupo nan dijalehkan sabalunnyo (58). Singkeknyo, sel-sel dirawat jo formaldehida (konsentrasi akhia 1,42%) jo diinkubasi pado suhu ruangan salamo 10 minik. Gunoan penyangga bangkak nan ditambahi (Hepes 25 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM jo NP-40 0,1%) di ateh es salamo 10 minik, kamudian disuspensi baliak dalam penyangga imunopresipitasi sarupo nan dijalehan (58 ). Sampel kamudian disonikasi jo siklus barikuik: 10 siklus (20 pulsa 1 datiak) jo wakatu statis 40 datiak. Inkubasi antibodi imunoglobulin G (Teknologi Pensinyalan Sel; 3 μl), histon H3 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) dan SP1 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3 μl) kelas ChIP jo barek sampel 4° Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) jo sampel pado suhu 4°C jo goyang lembut salamo 1 jam, lalu gunoan manik-manik chelex (Bio-Rad) untuak mampakayo DNA, jo gunoan proteinase K (Thermo Fisher) untuak pancernaan protein. Promotor TNFα dideteksi jo PCR: maju, GGG TAT TGT TGT TGT TGT; sabaliaknyo, GTG CCA ACA AKTA GCC TTT ATA TG (produk 207 bp). Gambar-gambar tu diproduksi dek Image Lab (Bio-Rad) dan diukua jo manggunoan perangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel dikumpuakan sarupo nan dijalehan di ateh. Panantuan dilakuan manuruik prosedur pambuek alat ELISA TNFα manusia (Invitrogen), alat ELISA IL-2 manusia (Invitrogen) jo alat ELISA IFN-γ manusia (Abcam). Manuruik protokol pambueknyo, supernatan diencerkan 1:100 untuak mandeteksi TNFα jo IL-2, sarato 1:3 untuak mandeteksi IFN-γ. Gunoan Pambaco Multilabel (PerkinElmer) untuak mangukua daya serap pado 450 nm.
PBMC dipisahkan dari produk pamisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) jo sentrifugasi kapadekan gradien Ficoll. Sel CD3 + diisolasi dari PBMC manggunoan manik-manik CD3 (Miltenyi). Ado atau indaknyo MNA, sel CD3+ diaktifkan jo CD3 nan takaik jo lempeng (5μg/ml), CD28 nan laruik (3μg/ml) jo IL-2 (300 U/ml; Proleukin) salamo 3 hari. Sasudah 3 hari, sel-sel dikumpuakan jo dibasuah jo garam 0,9%, dan pelet dibekukan sacaro capek. Hitungan sel dilakukan jo sitometri aliran (konfigurasi 3L-16V-14B-8R) manggunoan 123hitungan eBeads.
Ekstrak metabolit sarupo nan dijalehan di ateh. Ekstrak kariang direkonstitusi pado konsentrasi 4000 setara sel/μl. Analisa sampel jo kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori-pori 120-Å; #186008500). Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), dimano ionisasi elektrospray baoperasi dalam mode positif. Fase A nan bagerak adolah 0,1% asam formik (dalam H2O), fase B nan bagerak adolah 90% asetonitril, 0,1% asam formik. Gradien LC adolah 0 inggo 2 minik untuak 100% A, 2 inggo 7,1 minik untuak 99% B, jo 7,1 inggo 8 minik untuak 99% B. Kudian seimbangkan baliak kolom jo fase mobile A jo laju aliran 0,6 ml/min salamo 3 minik. . Laju alirannyo 0,4ml/min, jo ruang kolom dipanehan sampai 50°C. Gunoan standar kimia murni MNA (M320995, Perusahaan Kimia Riset Toronto, York Utara, Ontario, Kanada) untuak managakkan wakatu panyimpanan (RT) jo parubahan (RT = 0,882 minik, parubahan 1 = 137→94,1, parubahan 2 = 137→1293). Katiko katigo transisi tajadi pado wakatu retensi nan tapek, transisi 1 digunoan untuak kuantifikasi untuak mamastian spesifisitas. Kurva standar MNA (Perusahaan Kimia Riset Toronto) dihasiakan jo anam pangenceran barikuik dari larutan saham (1 mg/ml) untuak mandapekkan standar 0,1, 1,0, 10 jo 100 ng/ml sarato 1,0 jo 10μg/ml cairan masiang-masiang. Bateh deteksi adolah 1 ng/ml, jo tanggapan linier adolah antaro 10 ng/ml jo 10μg/ml. Satiok suntikan duo mikroliter sampel jo standar digunoan untuak analisis LC/MS, jo sampel kontrol mutu campuran dijalankan satiok lapan suntikan untuak mamastian stabilitas platform analisis. Tanggapan MNA dari sadoalah sampel sel nan dirawat jo MNA barado dalam jangkauan linier dari assay. Analisis data dilakukan jo manggunoan perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, agilent).
Konstruk αFR-CAR generasi kaduo diambiak dari Song dkk. (59) Singkeknyo, konstruk ko manganduang isi sarupo iko: urutan pamimpin CD8a, pacahan variabel rantai tungga spesifik αFR manusia, daerah engsel jo transmembran CD8a, domain intraseluler CD27 jo domain intraseluler CD3z. Urutan CAR langkok disintesis dek GenScript, dan kamudian dikloning ka dalam vektor ekspresi lentivirus generasi kaduo di hulu kaset ekspresi GFP nan digunoan untuak manelaah efisiensi transduksi.
Lentivirus dihasiakan jo transfeksi sel HEK293T [Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC); ditanam dalam medium Eagle nan dimodifikasi dek Dulbecco nan manganduang 10% serum sapi janin (FBS) jo 1% PenStrep, dan digunoan vektor CAR-GFP dan Plasmid kemasan (pspax2 dan pMD2.G, Addgene) manggunoan amina lipofeksi (Sigma-Aldrich). Supernatan nan manganduang virus dikumpuakan 48 jo 72 jam sasudah transfeksi, disaring, jo dikonsentrasikan jo caro ultrasentrifugasi. Simpan supernatan virus nan alah dikonsentrasikan pado suhu -80°C sampai ditransduksi.
PBMC dipisahkan dari produk pamisahan leukosit donor nan sehat (Teknologi SEMEL) jo sentrifugasi kapadekan gradien Ficoll. Gunoan mikromanik CD8 pamiliahan positif (Miltenyi) untuak mangisolasi sel CD8+ dari PBMC. Marangsang sel T jo TransAct (Miltenyi) jo dalam medium TexMACS [Miltenyi; ditambah jo 3% serum manusia nan indak diaktifkan dek paneh, 1% Penstrep jo IL-2 (300 U/ml)]. Duo puluah ampek jam sasudah rangsangan, sel T ditransduksi jo lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 sampai 3 hari sasudah transduksi pado Cytek Aurora (pado FSC (Tamburan Maju)/SSC (Tamburan Sampiang), Tunggal, GFP+), manelaah ekspresi GFP sel untuak manunjuakan efisiensi transduksi sakurang-kurangnyo 30% .
Sel CAR-T dibudidayakan salamo 24 jam dalam Imunokul (Teknologi STEMCELL; ditambahi jo 1% PenStrep) dalam kondisi barikuik: indak dirawat, dirawat jo adenosin 250 μM atau MNA 10 mM. Sasudah pra-pangobatan, sel CAR-T dibasuah jo PBS dan digabuangan jo 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; pado media McCoy 5A (Sigma-Aldrich) nan ditambahi jo 10% FBS jo 1% PenStrep pado 10: Rasio efektor jo sasaran 1 dikuekkan dalam tigo kali lipek pado media Imunokult nan ditambahi. Sel SK-OV-3 jo sel SK-OV-3 nan dilisi jo saponin digitalis (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) masiang-masiang digunoan sabagai kontrol negatif jo positif. Sasudah 24 jam dibudidayakan basamo, supernatan dikumpuakan dan laktat dehidrogenase (LDH) diukua sasuai jo instruksi pambueknyo (Kit Uji Sitotoksisitas Glo LDH, Promega). Supernatan LDH diencerkan 1:50 dalam penyangga LDH. Persentase pambunuahan diukua manggunoan rumus barikuik: persentase pambunuahan = persentase koreksi / tingkat pambunuahan maksimum x 100%, dimano persentase koreksi = ko-kultur-sel T sajo, jo tingkat pambunuahan maksimum = kontrol positif-kontrol negatif.
Sarupo nan dijalehkan dalam teks atau bahan jo caro, gunoan GraphPad Prism 8, Microsoft Excel atau R v3.6.0 untuak analisis statistik. Jikok babarapo sampel dikumpuakan dari pasien nan samo (sarupo asma jo tumor), kami manggunoan uji t basandiang atau mamasuakan pasien sabagai efek acak dalam model linier atau umum sasuai. Untuak analisis metabolomik, uji kapantiangan dilakukan dalam tigo kali lipek.
Untuak bahan tambahan untuak artikel ko, silakan caliak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Iko adolah artikel akses tabukak nan didistribusikan di bawah syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, nan mamungkinkan panggunoan, distribusi jo reproduksi dalam media apo sajo, asalkan panggunoan akhia bukan untuak kauntuangan komersial dan premisnyo baso karya aslinyo batua. Reperensi.
Catatan: Kami hanyo mamintak Sanak untuak manyadiokan alamat email Sanak supayo urang nan Sanak rekomendasikan ka laman tu tahu baso Sanak nio inyo mancaliak email tu dan baso itu bukan spam. Kami indak akan manangkap alamat email apopun.
Pertanyaan ko digunoan untuak mauji apokah Sanak adolah pangunjuang dan mancagah pangiriman spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jonesph (John. (Rusel G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA mambarikan kontribusi pado panakanan imun sel T jo mawakili sasaran imunoterapi nan bapotensi untuak ubek kanker manusia.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jonesph (John. (Rusel G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA mambarikan kontribusi pado panakanan imun sel T jo mawakili sasaran imunoterapi nan bapotensi untuak ubek kanker manusia.
©2021 Asosiasi Amerika untuak Kamajuan Ilmu Pengetahuan. sagalo hak dilindungi. AAAS adolah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kamajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.