Tarimo kasih alah mangunjungi Nature.com.Versi palayar nan Sanak gunoan punyo dukuangan tabateh untuak CSS.Untuak pangalaman nan paliang rancak, kami sarankan Sanak manggunoan palayar nan diperbarui (atau mamatian mode kompatibilitas di Internet Explorer).Samantaro itu, untuak mamastian dukuangan taruih manaruih, kami akan manampilan situs tanpa gaya jo JavaScript.
Babeda jo vertebrata, sarangga banyak dianggap kurang hormon steroid seks nan bias pado jantan.Pado Anopheles gambiae, steroid ekdison 20-hidroksiekdison (20E) tampaknyo alah baevolusi untuak mangandalikan pakambangan talua katiko disintesis dek batino jo caro manginduksi transseksual jantan2. perkembangan talua jo kawin adolah sipaik reproduksi nan pantiang, mamahami baa nyamuak Anopheles batino mangintegrasikan sinyal hormonal ko dapek mamudahkan rancangan program pangandalian malaria baru. ekdison nan taoksidasi, 3-dehidro-20E (3D20E), nan malinduangi katurunan jo manutup reseptivitas seksual padusi sasudah pamindahan seksual jo aktivasi jo defosforilasi. 20E nan barasa dari padusi indak manciptakan tanggapan seksual, tapi mamungkinkan individu nan kawin untuak batalua sasudah kinase nan manghambat 20E dihambat. kasuksesan reproduksi nyamuak nan manularkan malaria.
Kasus jo kamatian malaria samakin maningkek baliak4 dek resistensi insektisida nan laweh pado nyamuak Anopheles, satu-satunyo vektor parasit malaria manusia.Biologi kawin nyamuak ko marupoan sasaran nan sangaik manarik untuak intervensi pangandalian malaria baru karano batino hanyo bakawin sakali5; mambuek kajadian kawin tunggal ko steril akan mampunyoi potensi gadang untuak mangurangi populasi nyamuak di lapangan.
Padusi manjadi cacat seksual sasudah manarimo hormon steroid titer tinggi dari laki-laki.Panalitian alah manunjuakan baso pamicu kasulitan dalam kawin labiah lanjuik adolah 20-hidroksiekdison (20E), hormon steroid nan labiah dikenal sabagai pangatur siklus molting pado tahap larva nan dipindahan sacaro spesifik pado E. Spesies Anopheles nan marupoan bagian dari subgenus Cellia7, nan tasebar di Afrika dan tamasuak vektor malaria nan paliang babahayo, tamasuak Anopheles gambiae. dimano batino mangintegrasikan sinyal dari duo sumber ekdison nan babeda (transfer jantan jo induksi makan darah) tanpa mambahayakan kamampuannyo surang untuak bakawin.Padohal, jikok 20E nan dihasiakan dek batino mamicu intoleransi seksual, hal iko akan manyababkan mandul pado individu nan makan perawan, suatu perilaku nan sangaik umum pado moquit5 ko.
Panjalehan nan mungkin adolah baso A. gambiae jantan mamindahan ekdison spesifik jantan nan dimodifikasi, nan maaktifkan kaskade sinyal di saluran reproduksi batino, nan maakibaikan katidakstabilan kawin. steroid alun diidentifikasi pado sarangga.
Kami barangkek untuak manantukan repertoar hormon steroid pado kelenjar aksesori jantan (MAG) dari A. gambiae nan alah dewasa sacaro seksual untuak mancari kamungkinan steroid nan mamodifikasi. pado jaringan iko, mamastian hasil sabalunnyo.Namun, sampel didominasi dek steroid fosforilasi nan taoksidasi, konsisten jo rumus 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Gambar 1).Bantuak lainnyo tamasuak 3-dehidro-20E-20E (D-20E) (20E22P).Intensitas sinyal HPLC-MS/MS dari 3D20E22P duo urutan labiah tinggi dari bantuaknyo nan didefosforilasi, 3D20E, dan tigo urutan labiah tinggi dari E jo 20E (Gambar 1). 1a).Kami juo manganalisis ekdisteroid pado jantan jo batino nan baru tatutuik (<1 hari) dan mandeteksi 3D20E jo 3D20E22P hanyo pado MAG; E, 20E jo 20E22P ado pado kaduo jinih kalamin (Data Paluasan Gambar 1b).Data ko manunjuakan baso A. gambiae jantan dewasa manghasilkan titer tinggi hormon modifikasi pado MAGnyo nan indak disintesis dek batino.
MAG jo LRT batino (tamasuak atrium, vesikel mani, jo parovarium) dibedah dari jantan perawan baumua 4 hari (4 hari) jo batino perawan jo kawin (0,5, 3, jo 12 hpm). tingkat penemuan (FDR) dikoreksi; NS, indak signifikan; *P < 0,01 .3D20E: 3 jam vs 0,035; 3D20E22P: 3 jam vs 0,5 jam, P = 0,25; 12 jam vs 3 jam, P = 0,0032; 12 jam vs 0,5 jam, P = 0,015).Data adolah dari tigo replika biologis nan dinormalkan dari nyamuak.Ekdison diwakili jo warna sarupo barikuik: E, hijau; 20E, warna oranye; 20E22P, warna ungu; 3D20E, warna biru; 3D20E22P, warna pink.Inset maningkekan skala pado sumbu y untuak manunjuakan kadar ekdison nan labiah randah.
Untuak manyalidiak apokah 3D20E22P jo 3D20E dipindahan salamo kawin, kami mambedah LRT batino pado babagai titiak wakatu sasudah kawin.Walaupun ekdison indak ditamukan pado anak dara, kami mangamati jumlah substansial 3D20E22P pado LRT nan maningkek sacaro langsuang sasudah h5ma,a. Manggunoan 3D20E nan disintesis sacaro kimia sabagai standar, kami manantukan baso kadar hormon steroid ko pado LRT kawin paliang indak 100 kali lipek labiah tinggi dari 20E (Tabel Data Paluasan 1). LRT padusi salamo kawin, jo bantuaknyo nan difosforilasi, 3D20E, manjadi sangaik malimpah indak lamo sasudah kawin. Hal iko manunjuakan peran pantiang untuak ekdison nan tarakhia dalam biologi pasca kawin padusi.
Sasudah manghasilkan dataset urutan RNA (RNA-seq) baru (Gambar 2a), manggunoan pipa bioinformatika nan dibuek khusus, kami mancari ekdison kinase (EcK), ekdison oksidase (EO), jo ekdison nan manyandikan gen fosfatase nan dimodifikasi 20E nan diekspresikan ulang. Gen EPP jo duo gen EcK nan bapotensi (EcK1 jo EcK2), tapi indak dapek manamukan calon gen EO nan elok.Tantarutamo, gen EPP individu diekspresikan pado tingkek tinggi (persentil ka-98,9) pado MAG Gambia tapi indak pado LRT padusi (Gambar 2b), balawanan jo harapan kami. jaringan padusi ko.Dek karano itu, kami picayo baso EPP jantan mungkin dipindahan salamo kawin.Memang, kami manggunoan pelabelan isotop stabil in vivo untuak mamaliaro protein padusi sasudah kawin, enzim nan diidentifikasi dek MS di atrium perawan padusi (Gambar 2c dan Tabel Tambahan juo adolah EPP padusi dan padusi). dikonfirmasi jo manggunoan antibodi tatantu (Gambar 2d).
a, Sabuah pipa bioinformatika nan dibuek khusus untuak mancari jaringan reproduksi satiok jinih kelamin untuak gen nan manyandikan EcK, EO, jo EPP.Angko-angko di sampiang anak panah manunjuakan jumlah calon laki-laki jo padusi pado satiok langkah.Analisis ko mangidentifikasi ciek gen EPPE jo exK1) jantan, jo ciek gen EcK (EcK2) nan diekspresikan pado kaduo jinih kalamin tapi indak mahasilkan calon gen EO.b, Peta angek mambandiangkan ekspresi gen calon pado jaringan perawan (V) jo kawin (M) Anofel gambiae jo Anofel albikans.Spca, pembuahan; MAG, kelenjar aksesori pado jantan; bagian tubuah lainnyo, tamasuak payudara, sayap, kaki, tubuah nan lamak, jo organ dalam pado kaduo jinih kalamin, jo ovarium pado padusi.EcK2 diekspresikan tinggi baiak pado MAG maupun atrium Gambia, sadangkan EPP hanyo tadapek pado MAG.c, Analisis proteomik kalompok transloria ejakulat jantan pado2. hpm, manunjuakan 67 protein nan paliang banyak.Padusi dipaliharo jo makanan nan manganduang 15N untuak malabeli (dan mamasang topeng) sadoalah protein.Jantan nan indak ditandai dikawinkan jo batino nan ditandai, dan LRT batino dibedah pado 3, 12 jo 24 hpm untuak analisis tambahan proteomik untuak Tabel a1. d, EPP tadeteksi jo western blot pado MAG jo LRT batino nan lah kawin, tapi indak pado batino perawan atau jantan atau sisa tubuah padusi nan dimuek sacaro sarantak. antibodi anti-EPP.Sadonyo jantan adolah perawan.Liek Gambar Tambahan 1 untuak data sumber gel.Blot barat dilakukan duo kali jo hasil nan sarupo.
Aktivitas ekdisteroid fosfosfatase EPP diverifikasi sasudah inkubasi jo HPLC-MS/MS jo 3D20E22P nan diisolasi dari MAG (Data Paluasan Gambar 2a). (Gambar 3a), dan batino nan dikawinkan jo jantan nan dibuniakan EPP manunjuakan signifikan A proporsi 3D20E nan labiah randah dari defosforilasi (Gambar 3b) meskipun dibunyikan gen parsial (Data Diluaskan Gambar 2b, c).Sabaliaknyo, kami indak mandeteksi parubahan signifikan pado rasio mo2 manyarankan baso enzim iko spesifik untuak 3D20E22P (Gambar 3b).
a, Panurunan aktivitas fosfatase pado MAG nan disababkan dek pambungkam EPP manggunoan kontrol RNA EPP untai ganda (dsEPP) atau RNA GFP untai ganda (dsGFP). dikawinkan jo jantan nan diamkan EPP mampunyoi proporsi 3D20E nan didefosforilasi sacaro signifikan labiah randah pado 3 hpm (P = 0,0043, uji t indak basandiang, duo sisi), sadangkan kadar 20E indak tapangaruah (P = 0,063, indak basandiang). t-uji, duo sisi).Data disajikan sabagai rata-rata ± sem dari tigo kolam 13, 16 jo 19 batino masiang-masiang.c, Padusi nan dikawinkan jo jantan nan diamkan EPP punyo tingkat kawin baliak sacaro signifikan labiah tinggi (P = 0,0002, uji kawin eksak Fisher untuak status kawin partamo untuak duo sisi; 2 hari kamudian, mareka dihubungi jo jantan lain nan mambaok sperma transgenik untuak manilai tingkat kawin ulang jo deteksi PCR kuantitatif dari transgen.d, Padusi nan diagiah makan darah nan dikawinkan jo jantan nan diamkan EPP alah manurunkan kesuburan sacaro signifikan (P < 0,0001; uji Mann-Whitney jumlah = cahayo = duo). 0,088, uji Mann-Whitney, duo sisi) , samantaro tingkat pambuahan indak tapangaruah (P = 0,94, uji tapek Fisher, duo sisi).Pado sadoalah panel, n mawakili jumlah sampel nyamuak nan mandiri sacaro biologis.NS, indak signifikan.*P < **P <0,05,1. **P < 0,001.
Salanjuiknyo, kami manilai apokah defosforilasi ekdison pantiang untuak manginduksi resistensi kawin pado padusi. kesuburan (Gambar 3d, kiri) dan saketek panurunan jumlah talua nan dibuek dek batino ko (Gambar 3d, tangah), sadangkan persentase talua nan dibuek dek batino (tanggapan lain nan dihasilkan pado batino jo caro kawin )) indak tapangaruah (Gambar 3d, kanan hasil pengamatan untuak EPP2). manyarankan baso aktivasi 3D20E dek EPP nan dipindahan salamo kawin mungkin mampunyoi peran pantiang dalam mamatian reseptivitas padusi untuak kawin labiah lanjuik, suatu parilaku nan sabalunnyo dianggap sabagai pamindahan seksual 20E .Dek karano itu, hormon spesifik laki-laki ko juo sangaik mampangaruahi kasuburan padusi.
Salanjuiknyo, kami mambandiangkan aktivitas 20E jo 3D20E dalam eksperimen suntikan pado anak dara nan alah dewasa sacaro seksual manggunoan 3D20E nan disintesis sacaro kimia (Gambar 4a-c) jo 20E nan tasadio sacaro komersial. (Gambar 4d).Nan tanamo, satangah dari tingkek fisiologis 3D20E pado LRT (1.066 pg pasca suntikan vs 2.022 pg pasca kawin) manginduksi proporsi batino nan refrakteris nan 20 kali lipek labiah tinggi daripado tingkek fisiologis 20g pasca suntikan pado p1g3. konsentrasi paliang tinggi 18 pg pasca kawin; Tabel Data Diluaskan 1).Hasil iko konsisten jo gagasan baso pamindahan seksual 20E indak manyababkan periode refrakteri kawin, dan labiah lanjuik manunjuak ka 3D20E sabagai faktor utamo dalam mamastian hubungan urang tuo-anak. tingkat pambuangan talua normal nan kami amati sasudah pambungkam EPP parsial adolah dek adonyo aktivitas 3D20E nan tasiso nan masih dihasiakan dek faktor padusi nan diinduksi dek Kawin.
(a,b) 3D20E disintesis sacaro kimiawi dari 20E (a) jo konversi/efisiensi nan sangaik tinggi (data disajikan sabagai rata-rata ± sem dari tigo reaksi sintesis mandiri) (b).c, Spektrum massa (satangah bawah) persis sasuai jo ekdison nan tadapek pado LRT padusi nan dikawinkan (satangah ateh jo).d. 0,02; 0,21 μg, P < 0,0001; uji eksak Fisher, duo sisi) jo 10% etanol (0,63 μg, P < 0,0001; 0,21 μg, P < 0,0001 uji hanyo labiah tinggi pado 0,0001; dosis nan labiah tinggi (0,63 μg, P = 0,0002; 0,21 μg, P = 0,54; uji tapek Fisher, 2 sisi).e, suntikan 3D20E manginduksi tingkat pambiakan nan labiah tinggi sacaro signifikan pado batino perawan daripado kontrol etanol 10%, P 0,13 μg, P = 0,0003; uji tapek Fisher, duo sisi), sadangkan 20E dibandiangkan jo kontrol Hanyo pado dosis nan labiah tinggi (0,21 μg, P = 0,022; 0,13 μg, P = 0,0823 signifikan-exa2d Fisher). tingkat pambuahan dari 20E pado dosis nan labiah tinggi (0,21 μg, P = 0,0019; 0,13 μg, P = 0,075; uji eksak Fisher, duo sisi).Pado sadoalah panel, n mawakili jumlah sampel nyamuak nan signifikan mandiri sacaro biologis,**P, indak <0.0. ***P < 0,001, ****P < 0,001.Data adolah dari tigo ulangan.
Dalam panalitian sabalunnyo, kami manantuan baso pamindahan seksual hormon steroid manginduksi ekspresi MISO (Stimulator Oogenesis Induksi Kawin 11), gen reproduksi padusi nan malinduangi A. Kabugaran Anopheles di daerah endemik malaria, kami mamutuihan untuak manantukan hormon mano 3D20E atau 20E nan mamicu ekspresi gen ko. Dengan demikian, pamindahan seksual hormon steroid androgenik ko tampaknyo manginduksi mekanisme nan malinduangi padusi dari biaya nan ditimbulkan dek infeksi parasit nan babeda. E reseptor EcR, manginduksi EcR-A jo manakan EcR-B, dan labiah kuek mamicu gen induksi kawin lainnyo, tamasuak HPX15, nan mampangaruahi kasuburan padusi. labiah disukoi diaktifkan dek duo hormon ekdison nan mungkin mandasari fungsi spesifik jinih kelamin.
Salanjuiknyo, kami mauji fungsi dari duo gen EcK nan diidentifikasi dalam pipa bioinformatika kami.Pambungkam EcK1 atau EcK2 maakibaikan kamatian nan signifikan pado jantan (Data Paluasan Gambar 4a), nan manunjuakan baso fosforilasi ekdison, dan sahinggo inaktivasi, pantiang untuak kalangsuangan hiduik labiah tinggi daripado EcK2. 2b, c jo Tabel Tambahan 2), kami mamvalidasi aktivitas kinase ekdisteroidnyo jo caro manginkubasinyo jo 20E, nan mahasilkan fosforilasi 20E22P (Data Paluasan Gambar 2). 3D20E22P (Data Paluasan Gambar 4c), nan manunjuakan baso 20E daripado 3D20E mungkin manjadi sasaran nan disukoi EcK2.
Manuruik analisis RNA-seq kami, EcK2 juo diekspresikan tinggi pado LRT batino perawan, dimano inyo dimatian sasudah kawin (Gambar 2b).Kami mamastian data ko dan manantukan baso ekspresi EcK2 indak dipangaruahi dek pakan darah (Data Perpanjangan Gambar 5a).Mampaluahkan kami peitiak dari, 20E22P bakaik arek jo puncak 20E (22-26 jam sasudah makan darah; Data Diluaskan Gambar 5b).Pambungkam EcK2 pado padusi perawan maakibatkan paningkekan 3 kali lipek pado rasio relatif 20E jo 20E22P pado 26 h Data me EcK2 juo mafosforilasi 20E pado padusi. dari 30% dari anak dara nan batalua (Data Diluaskan Gambar 5f).Jikok suntikan RNA Eck2 untai ganda (dsEcK2) dilakukan sasudah makan darah, pemijahan indak tajadi, pado titiak itu puncak 20E dek manalan darah alah manurun sasudah hasil dukuangan ko. pemijahan, tapi hanyo katiko blok pemijahan (EcK2 dan mungkin faktor lain) dimatian jo caro kawin.Baik suntikan 20E maupun 3D20E indak menghambat ekspresi EcK2 pado anak dara (Data Perluasan Gambar 5g), nan manunjuakan baso faktor lain adolah mediasi penghambatan bloHover tingkek kinase2 ko. cukuik untuak manginduksi katidaknyamanan kawin, tapi sacaro efektif dipicu dek titer tinggi 3D20E nan dipindahan sacaro seksual.
Hasil kami mambarikan wawasan pantiang tantang mekanisme nan mangatur kasuksesan reproduksi A. gambiae. Sabuah model alah muncua di mano jantan alah baevolusi untuak mansintesis titer tinggi 3D20E, ekdison nan dimodifikasi spesifik jantan nan manjamin katurunan jo caro mandesensitisasi batino untuak kawin malaria labiah lanjuik. maaktifkan 3D20E pado batino sabagai tanggapan taradok pamindahan seksual EPP spesifik jantan.Sapanjang pangatahuan kami, iko adolah contoh partamo dari sistem hormon steroid nan didominasi jantan jo padusi nan malakukan fungsi nan unik jo kritis pado sarangga.Fungsi ekdison spesifik jantan alah ditunjukkan sacaro definitif atau indak. hipotesis 18 adolah baso fungsi-fungsi iko mungkin dilakukan dek prekursor 20E E1.Alah dikatahui baso pado Drosophila, monandry dipicu dek pamindahan seksual peptida jinih kelamin ketek19,20 nan bainteraksi jo neuron nan manyarapi saluran reproduksi padusi nan manantukan sinyal2 reseptor jinih kelamin2 hilir1 lainnyo. kaskade nan dikendalikan dek 3D20E pado A. gambiae batino jo untuak manantuan apokah kaskade ko dapek dilestarikan antaro nyamuak jo Drosophila.
Maingek peran pantiang 3D20E pado kasuburan jo parilaku padusi nan diidentifikasi dalam panalitian kami, jalur-jalur nan mangarah pado sintesis jo aktivasi 3D20E manawarkan paluang baru untuak strategi pangandalian nyamuak di maso datang, sarupo generasi jantan imita steril pado strategi sarangga steril untuak malapehan baliak main perawan.Fungsi spesifik jantan dari 3D20E mungkin alah baevolusi katiko A. gambiae jo spesies Cellia lainnyo mandapekkan kamampuan untuak mangakua maninyo manjadi colokan kawin, karano hal iko mamungkinkan untuak pamindahan nan efisien dari sajumlah gadang hormon jo enzim nan maaktifkan hormon. (malalui ekspresi tinggi MISO) untuak mandukuang kabugaran reproduksi mareka di daerah prevalensi malaria tinggi, nan sacaro indak langsuang mambarikan kontribusi pado panularan Plasmodium. kini aspek kunci dari interaksi nyamuak-parasit.
A. gambiae strain G3 dipaliharo dalam kondisi sarangga standar (26-28 °C, kalembaban relatif 65-80%, fotoperiode cahayo/gelap 12:12 h). nyamuak diagiah makan ad libitum larutan dekstrosa 10% jo darah manusia mingguan (komponen darah kajian).Nyamuak perawan didapek jo caro mamisahkan jinih kelamin pado tahap pupa sasudah mamareso ujuangnyo jo mikroskopi.Jantan nan mambaok transgen DsRed alah dijalehan sabalunnyo.
Percobaan kawin paksa dilakukan manuruik protokol nan dijalehan sabalunnyo.Untuak kawin alami, batino perawan baumua 4 hari disimpan dalam rasio 1:3 jo jantan perawan nan dewasa sacaro seksual salamo duo malam.Untuak percobaan dimano jantan disuntikkan jo dsEPP, aktivitas co-caging di-days bertepatan jo,4. diamkan sacaro maksimal (Data Dipanjangan Gambar 2b).
Jaringan nyamuak, bangkai nan tasiso (sisa tubuah), atau saluruah tubuah dibedah manjadi 100% metanol dan dihomogenkan jo manik-manik (manik kaco 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik).Jumlah jaringan jo volume metanol adolah sarupo barikuik: sisa tubuah,50 μ0. MAG, 50-100 80 μl; LRT padusi, 25-50 80 μl.Endapan diagiah ekstraksi metanol kaduo jo volume metanol nan samo.Puing-puing sel dikaluakan jo sentrifugasi.Metanol dari kaduo ekstraksi digabuangan dan dikariangan di bawah aliran nitrogen, kamudian disuspensikan baliak dalam volume metol dari80. 50 ul; MAG jo LRT padusi, 30 μl.
Sampel dianalisa pado spektrometer massa (ID-X, Termo Fisher) nan digabuangan jo instrumen LC (Vanquish, Termo Fisher). (aia, 0,1% asam formik) jo B (asetonitril, 0,1% asam formik).Gradien LC adolah sarupo barikuik: 5% B salamo 1 minik, kamudian maningkek manjadi 100% B salamo 11 minik.Sasudah 8 minik pado suhu 100%, imbangi baliak aliran ra B salamo4. ml min-1.Ionisasi pado sumber MS dicapai jo ionisasi elektrosemprot nan dipanehan dalam mode positif jo negatif.
Spektrometer massa mangukua data dalam kisaran m/z dari 350 sampai 680 pado resolusi 60.000 dalam mode MS panuah. untuak nan indak ado standar nan tasadio.Untuak maidentifikasi ekdisteroid nan indak ditargetkan, data MS/MS untuak sadoalah puncak HPLC jo >15% kalimpahan relatif dianalisa. laki-laki.Untuak 3D20E, kuantifikasi dilakukan jo manggunoan jumlah aduk barikuik: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. spektrum E, 20E jo 3D20E dibandiangkan jo standar masiang-masiang.3D20E22P dianalisa jo caro turunan jo reagen Girard.20E22P dianalisa jo rasio m/z.
3D20E22P dimurnikan dari MAG.Pamurnian dilakukan pado skala analitis manggunoan kromatograf cairan kinerja ultra (Kakuatan, Parairan) jo detektor berbasis massa kuadrupol (QDa, Kakuatan, Parairan) dalam kondisi LC nan samo jo analisis korreksi HPLC-MS/MS. 3D20E22P tadeteksi pado wakatu retensi nan samo jo nan ditantuan sabalunnyo.Kamurnian senyawa nan diekstraksi kamudian dipareso jo HPLC-MS/MS sarupo nan dijalehan di ateh.
Total RNA diekstraksi dari 10-12 jaringan reproduksi atau bagian tubuah lainnyo (tanpa kapalo) manggunoan reagen TRI (Thermo Fisher) manuruik instruksi pambueknyo. Instruksi pambueknyo.Primer untuak PCR kuantitatif transkripsi tabaliak (RT-qPCR; Tabel Data Diluaskan 2) sabalunnyo alah dipublikasikan24 atau dirancang manggunoan Primer-BLAST26, jo piliahan diagiah pado produk ukuran 70-150 bp jo mancakuik simpang ekson-ekson pak. ampek ulangan biologis diencerkan ampek kali lipek dalam aia untuak RT-qPCR. dan data dikumpuakan jo dianalisa manggunoan Desain jo Analisis (versi 2.4.3).Sarupo nan ditunjukkan dalam panalitian ko, jumlah relatif dinormalisasi pado gen ribosom RpL19 (AGAP004422), nan ekspresinyo indak barubah sacaro signifikan jo pakan darah 27 atau kawin 3 .
Kualitas RNA dipareso jo manggunoan Bioanalisa Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent).Perpustakaan Illumina nan bapasangan disusun dan dijalankan di Broad Institute of MIT jo Harvard.Bacoan urutan dijajarkan jo genom A. parameter.Bacoan jo skor kualitas pemetaan (MAPQ) <30 dihapuih manggunoan Samtools (versi 1.3.1).Jumlah pambacoan nan dipetakan ka gen dietong manggunoan htseq-hitungan (versi 0.9.1) jo parameter bawaan. 1.28.1) dalam R (versi 4.0.3).
Calon gen nan mamodifikasi ekdison diidentifikasi jo caro partamo mancari genom A. gambiae manggunoan algoritma PSI-BLAST ( NP_001038956.1), Musca domestica (No. Aksesi XP_005182020.1, XP_005175332.1 jo XP_011294434.1) jo Parusak Mikroplitis (No. EcK dari B. mori (No. Aksesi NP_001036900), Drosophila Melanogaster (No. Aksesi NP_651202), Apis Mellifera (No. 001947166); dan EPP dari B. mori (No. Aksesi XP_001947166) dan EO dari D. pacahan/ekson kilobasa per juta pambacoan nan dipetakan (FPKM) atau >85%) pado jaringan reproduksi (LRT atau MAG padusi) di Gambia (langkah 2 ). Untuak maningkekan spesifisitas, kami mamiliah enzim calon nan juo diekspresikan pado jaringan reproduksi A. albimanus, spesies anofel nan indak mansintesis atau mamindahan ekdison salamo kawin. saringan akhia (langkah 4), gen calon paralu mamanuahi sakurang-kurangnyo salah satu dari barikuik: (1) sacaro signifikan diatur ka ateh sasudah kawin (P < 0,05) manuruik analisis gen nan diekspresikan sacaro babeda jo (2) pado jaringan non-reproduksi (< 85 % atau <100 FPKM).
Kami mamodifikasi metode nan dijalehan sabalunnyo 28,29,30 untuak mancapai pelabelan isotop saluruah organisme. 1,7% bebas asam amino jo amonium sulfat. media kultur) jo 5% amonium sulfat 15N (NLM-713, >99%, Laboratorium Isotop Cambridge) sabagai satu-satunyo sumber nitrogen.Ragi dipulihkan jo caro sentrifugasi dan larva nyamuak diagiah makan ad libitum sampai pupa. kamatian instar kaampek.Hanyo batino nan kamudian digunoan dalam eksperimen kawin jo jantan nan indak diagiah label untuak manganalisis proteom jantan nan dipindahan salamo kawin.
Pado 3, 12, jo 24 hpm, batino perawan nan diagiah tag 15N nan baumua 4-6 hari dipaso untuak bakawin jo jantan perawan nan indak diagiah tag nan sasuai jo umua.Pakawinan nan sukses diverifikasi jo mandeteksi colokan kawin di bawah mikroskop epifluoresensi.Pado 3, 12, jo 24 hpm, atrium jantan 45-5 dibedakan manjadi55. penyangga amonium bikarbonat (pH 7,8) dan dihomogenkan jo alus. dikirim samalam ka laboratorium MacCoss di Universitas Washington, di mano panyiapan sampel untuak LC-MS/MS salasai. mM ditiotreitol (DTT; Sigma), dialkilasi jo 15 mM yodoasetamida (Sigma) dan diinkubasi pado suhu 37 °C (1:0 50) salamo 1 jam jo tripsinisasi: rasio tripsin:substrat). sentrifugasi pado 14.000 rpm salamo 10 minik pado suhu 4 °C untuak maapuih puing-puing.Sampel dibasuah jo ekstraksi fase padat mode ganda (kartrid Oasis MCX, Parairan) dan disuspensi baliak dalam asam formik 0,1% untuak konsentrasi protein akhia 0,33 μg-μg-μU. sarupo itu pulo dianalisa dari jantan perawan.Dua replika analitis dianalisa untuak satiok sampel.Salanjuiknyo, 1 μg dari masiang-masiang dianalisa manggunoan kolom silika ulang manyatu 25 cm 75-μm jo silika manyatu 4 cm Kasil1 (PQ) jo perangkap frit pack2 (Fenomeneks) jo kromatografi cairan salamo 180 minik. Data akuisisi nan takaik jo data nan dihasiakan untuak satiok jalannyo diubah manjadi format mzML manggunokan Proteowizard (versi 3.0.2028) Basis data FASTA nan manganduang urutan protein dari Anopheles Gambiae (VectorBase versi 54), Anopheles Coluzzi Pancarian dilakukan pado Mali-NIH (VectorBase versi 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maret 2021), A. FDR nan cocok jo peta peptida ditantukan jo manggunoan Percolator32 (versi 3.05) jo ambang batas 0,01, dan peptida dirakit manjadi identifikasi protein manggunoan parsimoni protein di Limelight33 (versi 2.2.0). pado satiok lari sarupo nan dijalehan sabalunnyo.NSAF relatif pado satiok protein dirato-ratokan di saluruah sampel dari duo replika biologis nan babeda.15N pelabelan berhasil mamaliaro proteom padusi, walaupun sajumlah ketek protein nan indak balabeli dapek dideteksi dari anak dara nan dilabeli. lari teknis, dimano sampel mentah dijalankan sasudah sampel jantan/kawin, sabagai akibaik dari HPLC "mambaok labiah".Protein sakali-sakali nan ditamukan sabagai 'kontaminan' dari anak dara nan dilabeli dicantumkan dalam Tabel Tambahan 1.
Duo peptida antigenik, QTTDRVAPAPDQQQ (dalam isotipe PA) jo MESDGTTPSGDSEQ (dalam isotipe PA jo PB) dalam Genscript. jo pamurnian afinitas.IgG dari kelinci nan paliang spesifik EPP digunoan untuak blotting barat labiah lanjuik.
Untuak blot barat, MAG (n = 10, di mano n mawakili jumlah sampel nyamuak nan mandiri sacaro biologis) jo LRT batino (n = 30) dari jantan perawan baumua 4 hari jo batino perawan atau nan dikawinkan paksa (<10 pasca kawin), Penyangga ekstraksi protein (50 mM NP0; 0,25% natrium deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 × koktail panghambat protease (Roche)) ditambahkan sacaro tapisah. μg protein MAG, 40 μg protein LRT, jo 20 μg protein curah siso didenaturasi dan dipisahkan jo 10% penyangga MOPSPA. Membran dibasuah duo kali dalam 1× PBS-T (0,1% Tween-20 dalam PBS) dan kamudian diblokir dalam penyangga pamblokiran Odyssey (Li-Cor) salamo 1 jam jo suhu 22°C. Membran dibasuah jo PBS-T dan kamudian diinkubasi jo antibodi sekunder (antibodi keledai anti-kelinci 800CW jo kambiang800CW jo kambiang6. 1:20.000) dalam penyangga pamblokiran nan manganduang 0,01% SDS jo 0,2% Tween -20 salamo 1 jam pado suhu 22 °C.Membran dibasuah jo PBS-T dan dicitrakan jo pamindai Odyssey CLx. kDa) indak tadeteksi.
Daerah pangkodean EPP (sabagai isoform AGAP002463-RB nan manganduang domain histidin fosfatase, pancarian domain konservasi NCBI 34) jo EcK2 (AGAP002181) dikloning manjadi plasmid pET-21a(+); primer dicantumkan dalam Tabel Data Paluasan 2. Lapan pahubungan GS4 (sacaro basamo-samo) dimasuakkan sabalun tag C-terminal 6xHis dari konstruk pET-21a (+) - EcK2. Protein kontrol dihidrofolat reduktase (DHFR) diproduksi jo manggunoan cetakan DNA dari Kit Sintesis Protein E.
Aktivitas fosfatase EPP jo ekstrak jaringan diukua jo manggunoan 4-nitrofenil fosfat (pNPP; sigma-aldrich). dihomogenkan dalam penyangga reaksi dan puing-puing sel dikaluakan jo sentrifugasi.Mamulai reaksi jo manambahkan enzim atau ekstrak jaringan ka penyangga reaksi nan manganduang 2,5 mg ml-1 pNPP.Campuran reaksi diinkubasi pado suhu ruangan dalam kalam, dan jumlah pNP diukua pado 405 nm pado babagai wakatu.
Untuak aktivitas EcK in vitro, protein diinkubasi jo 0,2 mg 20E atau 3D20E dalam 200 μl penyangga (pH 7,5) nan manganduang HEPES-NaOH 10 mM, BSA 0,1%, ATP 2 mM jo reaksi Mg2a 10 mM pado suhu 2 h. 800 μl metanol, kamudian didinginkan pado suhu -20 °C salamo 1 jam, kamudian disentrifugasi pado suhu 20.000 g salamo 10 minik pado suhu 4 °C. min pado suhu 95 °C.
Untuak aktivitas EPP in vitro, protein diinkubasi jo 3D20E22P (satara jo jumlah nan ditamukan pado 18 pasang MAG, dimurnikan jo HPLC-MS/MS) dalam 100 μl penyangga (pH 7,5) nan manganduang Tris 25 mM, asam asetat Bi2s m50 m50 m0. NaCl, EDTA 0,1 mM, jo DTT 1 mM salamo 3 jam pado suhu 27 °C.Reaksi dihantikan jo manambahkan 400 μl metanol jo didinginkan pado suhu -20 °C salamo 1 jam, kamudian disentrifugasi pado suhu 20.000 g salamo 10 minik dianalisa pado suhu 4 °C.
Pacahan PCR untuak EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) jo EcK2 (556 bp) dikuekkan dari cDNA nan disusun dari bangkai nyamuak tanpa kapalo campuran jinih kalamin. pcr2.1-eGFP; Primer PCR dicantumkan dalam Tabel Data Paluasan 2. Pacahan PCR dimasuakkan antaro promotor T7 nan tabaliak pado plasmid pL4440. Konstruksi plasmid dipulihkan dari E. dsRNA ditranskripsikan dari cetakan PCR manggunoan Kit Transkripsi T7 Megaskrip (Thermo Fisher) untuak mampakuek sisipan dari plasmid berbasis pL4440. Ukuran produk PCR dikonfirmasi jo elektroforesis gel agarose. digambarkan.
Untuak suntikan dsRNA, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) disuntikkan pado konsentrasi 10 ng nl-1 ka dalam dada jantan atau batino dewasa (Nanoject III, Drummond) ditantuan baliak pado tingkek eklosi. Ekstraksi RNA, sintesis cDNA, jo RT-qPCR.Untuak suntikan ekdison, batino perawan baumua 4 hari atau perawan baumua 6 hari nan diagiah makan darah disuntikkan jo 0,13, 0,21, atau 0,63 μg konsentrasi 20E atau 3D. masiang-masiang, tagantuang pado rancangan percobaan atau 6,3 ng nl-1.Suntikkan 100 nl etanol 10% (vol/vol) dalam aia; 100 nl 3D20E22P dalam etanol 10% (satara jo 75% dari jumlah nan tadapek pado sapasang MAG).Nyamuak diagiah sacaro acak ka kalompok suntikan.
Untuak uji pambuahan, batino nan baumua 3 hari diagiah makan ad libitum pado darah manusia.Buang nyamuak nan diagiah makan sabagian atau indak diagiah makan.Tagantuang pado pangobatan, batino dilatakkan dalam cangkia pambuahan tapisah salamo ampek malam paliang indak 48 jam sasudah makan darah stereoskopi.S talua di bawah ); untuak batino nan lah bakawin, talua nan manatas manjadi larva dianggap subur.
Untuak uji coba kawin, batino dibuliahan paliang indak 2 hari tagantuang pado ubek untuak mangambangkan resistensi taradok kawin, jo jantan tipe liar nan sasuai jo umua salanjuiknyo dimasuakkan ka dalam kandang nan samo.Dua malam kamudian, vesikel nan dibuahi batino dibedah jo DNA bebas genom soni-thaning dikaluakan jo DNA1. Sampel diinkubasi jo Proteinase K (0,86 μg μl-1) salamo 15 minik pado suhu 55 °C, diikuti jo 10 minik pado suhu 95 °C. deteksi urutan kromosom Y; primer tacantum dalam Tabel Data Panjang 2.Indak adonyo urutan kromosom Y manunjuakan indak ado kawin.
Untuak assay kawin ulang, batino nan dikawinkan paksa diperiksa untuak adonyo colokan kawin untuak mamastian status kawin dan dibuliahan 2 hari untuak mangambangkan refraktoritas untuak kawin tanpa adonyo jantan, sarupo nan dijalehan sabalunnyo 36 .Jantan nan mambaok sperma transgenik DsRed nan mambuahan, kamudian dimasuakkan ka dalam induk la T. vesikel dibedah dari batino, jo DNA genom disusun sarupo nan dijalehan di ateh jo dilakukan deteksi qPCR dari transgen DsRed; primer tacantum pado Tabel Data Panjang 2.Indak adonyo transgen DsRed manunjuakan baso indak ado kawin ulang nan tajadi.
3D20E disintesis ulang sarupo nan dijalehan sabalunnyo 37 .Singkeknyo, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) dilaruikkan dalam 10 ml aia, diikuti jo panambahan 30 mg platinum hitam (dalam bantuak bubuak, Sigma-Aldrich). diaduk pado suhu ruangan.Sasudah 6 jam, 30 mL metanol ditambahkan untuak maambek reaksi.Campuran disentrifugasi untuak maapuih partikel katalis.Supernatan diuapkan sampai kariang dalam vakum pado suhu ruangan.Produk reaksi kariang dilaruikkan dalam ethanol dan%MSLCje-0. analisis.Tingkat konversi (dari 20E sampai 3D20E) kiro-kiro 97% (Gambar 4b), dan spektrum MS dari 3D20E nan disintesis cocok jo nan tadapek pado batino nan dikawinkan (Gambar 4c).
Tambo barisi rincian tatantu tantang uji statistik nan dilakukan.GraphPad (versi 9.0) digunoan untuak malakuan uji eksak Fisher, uji Mantel-Cox, jo uji t Student. Distribusi data diuji untuak normalitasnyo manggunoan uji Shapiro-Wilk jo ambang signifikansi 0,05.Katiko data gagal dalam uji normalitas, dilakukan uji Mann-Whitney. 1,28,1) digunoan untuak malakuan analisis ekspresi diferensial tingkek gen RNA-seq.Batang horizontal pado grafik mawakili median.Nilai signifikansi P = 0,05 digunoan sabagai ambang batas untuak sadoalah tes.
Untuak informasi labiah lanjuik tantang rancangan kajian, caliak abstrak Laporan Panalitian Alam nan dihubuangkan jo artikel ko.
Data proteomik MS disimpan ka dalam Konsorsium Pertukaran Proteome (proteomesentral) malalui Repositori Mitra PRIDE jo pangidentifikasi dataset PXD032157.
Dataset RNA-seq disimpan di Perpustakaan Komprehensif Ekspresi Gen di bawah catatan seri GSE198665.
Dataset tambahan nan dihasiakan dan/atau dianalisa salamo panalitian kini dapek diperoleh dari panulis nan sasuai ateh pamintaan nan wajar.Artikel ko manyadiokan data sumber.
De Loof, A. Ekdisteroid: Steroid jinih kalamin sarangga nan diabaikan?Jantan: Kotak Hitam.Ilmu Sarangga.13, 325-338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdison jo pambangunan ovarium pado Anopheles stepens.J. Fisiologi Sarangga.28, 97-109 (1982).