Panyortiran protein pado jalur sekresi sangaik pantiang untuak manjago kompartemen sel jo homeostasis. Salain panyortiran nan dimediasi cangkang, peran lipid dalam panyortiran kinesin dalam proses transportasi sekresi adolah patanyoan dasar nan alah lamo nan alun tajawab. Di siko, kami malakukan pencitraan wakatu nyato resolusi tinggi multiwarna simultan 3D untuak mambuktikan dalam vivo baso protein nan baru disintesis jo glikosilfosfatidilinositol nan diimobilisasi jo bagian lipid seramida nan sangaik panjang dikelompokkan dan diklasifikasikan manjadi endoplasma khusus Protein khusus nan babeda dari situs kalua transmembran itu, yaitu. Salain itu, kami manunjuakan baso panjang rantai seramida pado membran retikulum endoplasma sangaik pantiang untuak selektifitas panyortiran ko. Studi kami manyadiokan bukti langsuang in vivo partamo untuak mangklasifikasikan kargo protein badasarkan panjang rantai lipid manjadi situs ekspor selektif pado jalur sekresi.
Pado sel eukariotik, protein nan disintesis dalam retikulum endoplasma (ER) kamudian diuruik salamo transportasi malalui jalur sekresi untuak diantaan ka tujuan selulernyo nan sasuai (1). Salain panyortiran nan dimediasi lapisan, alah lamo dispekulasikan baso lipid tatantu dapek juo bafungsi sabagai titiak kalua selektif jo caro mangalompokkannyo ka dalam domain membran tatantu nan protein tatantu (2-5). Namun, masih kurang bukti in vivo langsuang untuak mambuktikan kamungkinan mekanisme babasis lipid ko. Untuak manyalasaian masalah dasar ko, kami mampalajari pado ragi baa protein nan balabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) diekspor sacaro babeda dari ER. GPI-AP adolah babagai protein pamukoan sel nan tasambuang jo lipid ( 6, 7). GPI-AP adolah protein nan disekresikan nan manempel pado daun lua membran plasma malalui bagian glikolipid (jangkar GPI). Mereka manarimo jangkar GPI sabagai modifikasi pasca-tarjamahan nan konservatif pado lumen ER (8). Sasudah malakek, GPI-AP malalui aparat Golgi (5, 9) dari ER ka membran plasma. Adonyo jangkar GPI manyababkan GPI-AP diangkuik tapisah dari protein nan disekresikan transmembran (tamasuak protein membran plasma lainnyo) di sapanjang jalur sekresi (5, 9, 10). Pado sel ragi, GPI-AP dipisahkan dari protein lain nan disekresikan pado retikulum endoplasma, dan kamudian dikemas manjadi vesikel unik nan dibungkuih dek kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Penentu proses klasifikasi ko dalam proses ekspor ER indak jaleh, tapi dispekulasikan baso mekanisme ko mungkin mamaralukan lipid, tarutamo pambuatan ulang struktural bagian lipid dari jangkar GPI (5, 8). Pado ragi, pambuatan lipid GPI dimulai sakutiko sasudah GPI manempel, dan dalam banyak kasus, manyababkan seramida maikek pado asam lemak jenuh barantai panjang 26 karbon (C26:0) (11, 12). Seramida C26 adolah seramida utamo nan dihasiakan dek sel ragi salamo ko. Inyo disintesis di ER dan sabagian gadangnyo diekspor ka aparat Golgi malalui vesikel COPII (13). Ekspor ER GPI-AP sacaro khusus mamaralukan sintesis seramida nan balanjuik (14, 15), dan pado gilirannyo, parubahan seramida manjadi seramida inositol fosfat (IPC) pado aparat Golgi tagantuang pado sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika jo membran buatan alah manunjuakan baso seramida rantai asil nan sangaik panjang dapek bagabuang untuak mambantuak domain nan tauruik jo sipaik fisik nan unik (17, 18). Data iko mangarah pado hipotesis baso seramida C26 jo GPI-AP jo seramida C26 manggunoan sipaik fisiknyo untuak bagabuang manjadi daerah atau daerah nan taratur di lingkuangan lipid membran ER nan relatif kacau. Tarutamo tadiri dari gliserolipid pendek jo indak jenuh (C16:1 jo C18:1) (19, 20). Daerah-daerah iko akan difokuskan sacaro selektif pado situs kalua ER tatantu (ERES), di mano seramida jo GPI-AP nan babasis seramida dapek diangkuik basamo ka Golgi dalam vesikel COPII nan didedikasikan nan samo (5).
Dalam panalitian ko, kami alah langsuang mauji mekanisme babasis lipid ko jo manggunoan mikroskopi pencitraan wakatu nyato konfokal resolusi super (SCLIM), nan marupoan teknik mikroskop mutakhir nan dapek sacaro sarantak mangamati protein nan diagiah label neon. (21, 22).
Kami partamo kali manerapkan teknologi SCLIM untuak labiah lanjuik mandefinisikan baa GPI-AP normal jo kalompok seramida C26 disaring dari protein nan disekresikan transmembran sasudah kalua dari ER pado S. Untuak mamareso klasifikasi ER, kami manggunoan sistem genetik nan dapek langsuang mamvisualisasikan muatan nan baru disintesis masuak ka ERES sacaro vivo (7, 23). Sabagai muatan, kami mamiliah Gas1 GPI-AP babasis seramida C26 nan diagiah label jo protein neon hijau (GFP) jo protein nan disekresikan transmembran Mid2 nan diagiah label jo protein neon inframerah dakek (iRFP), nan kaduonyo manargetakan membran plasma (24-26). Pado mutan sec31-1 nan peka jo suhu, kaduo muatan ko diekspresikan di bawah promotor nan dapek diinduksi galaktosa jo panando ERES nan marupoan. Pado suhu ekstrim (37°C), karano mutasi sec31-1 mampangaruahi fungsi komponen lapisan COPII Sec31 untuak mangambati perkecambahan COPII jo ekspor ER, muatan nan baru disintesis takumpua di ER (23). Sasudah didinginkan sampai suhu randah (24°C), sel-sel mutan sec31-1 pulih dari daerah sekresi, jo muatan sintetis baru nan takumpua mulai diekspor dari ER. Visualisasi CLIM manunjuakan baso sabagian gadang Gas1-GFP jo Mid2-iRFP nan baru disintesis masih takumpua di ER sel mutan sec31-1 sasudah diinkubasi pado suhu 37°C dan kamudian dikaluakan pado suhu 24°C salamo 5 minik (Gambar 1). Karano Mid2-iRFP tasebar pado saluruah membran ER, jo Gas1-GFP takonsentrasi jo takumpua di daerah membran ER nan indak taruih manaruih, distribusinyo samo sakali babeda (Gambar 1, A sampai C jo Film S1). Salain itu, sarupo nan ditunjukkan pado Gambar 1D, gugusan Gas1-GFP indak mampunyoi Mid2-iRFP. Hasia ko manunjuakan baso GPI-AP jo protein transmembran dipisahkan manjadi daerah membran ER nan babeda pado awalnyo. Gugusan Gas1-GFP badakek-an jo ERES tatantu nan diagiah label jo protein lapisan COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E jo F, jo film S1) (23).
sel sec31-1 mangaluaan sekresi nan diinduksi galaktosa, rantai asil panjang (C26) keramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) jo protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES Konstruktif ko diagiah pado minik, dipindahan ka 24°C, dan dicitrakan dek SCLIM 5 minik kamudian. (A sampai C) manunjuakan gambar 2D nan digabuangan atau tungga nan mawakili suatu bidang (A), gambar proyeksi 2D dari 10 bagian-z (B) atau gambar balahan sel 3D dari panando kargo jo ERES (C). Skala batang 1μm (A jo B). Satuan skalanyo adolah 0,551μm (C). Gas1-GFP tadeteksi pado daerah atau gugusan ER nan tapisah, sadangkan Mid2-iRFP tadeteksi jo tasebar di saluruah membran ER (C). (D) Grafik manunjuakan intensitas pendar relatif Gas1-GFP jo Mid2-iRFP pado gugusan Gas1-GFP sapanjang garih panah putiah (kiri). AU, satuan nan suko-suko sajo. (E jo F) mawakili gambar 3D nan manggabuangkan barang jo tando ERES. Gugusan Gas1-GFP tadeteksi dakek ERES tatantu. Satuan skalanyo adolah 0,551μm. (F) Panah padat putiah manandoi gugusan Gas1-GFP nan takaik jo ERES. Panel tangah jo kanan manunjuakan gambar 3D nan digabuangan nan digabuangan jo tampilan nan diputa dari gugusan Gas1-GFP nan dipiliah.
Hubungan spasial nan dakek antaro gugusan Gas1-GFP jo ERES tatantu manunjuakan baso Gas1-GFP dapek masuak ka ERES selektif, nan babeda jo selektifitas nan digunoan dek Mid2-iRFP untuak kalua dari ER. Untuak manyalasaikan kamungkinan iko, kami mangukua rasio ERES hanyo untuak ciek atau duo barang (Gambar 2, A sampai C). Kami manamukan bahaso kabanyakan ERES (70%) hanyo manganduang ciek jinih muatan. Gambar bawah Gambar 2C manunjuakan duo contoh khas ERES jo hanyo Gas1-GFP (Gambar 1) atau hanyo Mid2-iRFP (Gambar 2). Sabaliaknyo, labiah kurang 20% ​​dari ERES manganduang duo muatan nan tumpang tindih di daerah nan samo. Ditamukan baso babarapo ERES (10%) manganduang duo jinih muatan, tapi inyo diisolasi di daerah nan jaleh babeda. Dek karano itu, analisis statistik ko manunjuakan baso sasudah ER diekspor, GPI-AP Gas1-GFP jo muatan transmembran Mid2-iRFP dibagi manjadi ERES nan babeda (Gambar 2D). Efisiensi panyortiran ko sangaik sasuai jo analisis biokimia sabalunnyo (6) jo panantuan morfologis (7). Kito bisa pulo mengamati perilaku muatan nan dikarantina masuak ka ERES (Gambar 2E dan Film S2). Gambar 2E manunjuakan baso hanyo sabagian ketek dari Gas1-GFP (panel 3) atau Mid2-iRFP (panel 4) nan masuak ka ERES dari satu sisi dan dikuruang dalam daerah nan tapisah. Panel 5 dari Gambar 2E manunjuakan baso Gas1-GFP jo Mid2-iRFP kadang-kadang tadapek pado ERES nan samo, tapi inyo masuak dari sisi nan babeda dan takonsentrasi pado daerah tapisah nan mungkin mawakili vesikel COPII nan babeda. Kami juo managakan baso pamisahan jo klasifikasi nan diamati dari Gas1 GPI-AP nan babasis seramida C26 sabagai ERES selektif adolah spesifik karano muatan sekresi transmembran lainnyo, protein membran plasma nan ditandai GFP Axl2 (27 ), manunjuakan parilaku nan sarupo jo Mid2-iRFP. (Gambar S1 jo Film S3). Axl2-GFP nan baru disintesis didistribusikan malalui membran ER sarupo Mid2-iRFP (Gambar S1, A jo B), jo lokalisasi basamo jo Mid2-iRFP pado sabagian gadang ERES (Gambar S1, B sampai D). Panel 1 jo 2 dari Gambar 1. S1C manunjuakan duo contoh khas ERES di mano duo muatan transmembran tumpang tindih. Dalam kasus-kasus iko, kaduo barang tu masuak ERES basamo-samo (Gambar S1E, Panel 3 jo Film S3).
Sel-sel sec31-1 nan mangekspresikan sekresi induksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) jo Mid2-iRFP (TMP, biru) sarato pelabelan ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) dilatakkan pado suhu 37 Sasudah diinkubasi sekresi salamo 30 °C inggo 30 °C. blok, dan gambar jo SCLIM sasudah 20 minik. (A sampai C) Gambar proyeksi 2D nan mawakili (A; batang skala, 1μm) atau gambar balahan sel 3D (B jo C; satuan skala, 0,456μm) dari muatan jo 10 bagian-z nan ditandoi dek ERES. Panel bawah pado (B) jo panel pado (C) manampilkan gambar nan diolah untuak manampilkan hanyo barang nan ado pado ERES (warna magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) jo Mid2-iRFP (biru mudo)]. (C) Panah tabukak: ERES hanyo mambaok ciek muatan (1 sampai 4). Panah abu-abu: ERES manganduang muatan nan dipisahkan (5). Panah padat putiah: ERES nan manganduang muatan nan talatak basamo. Di bawah: ERES tungga nan dipiliah hanyo manganduang Gas1-GFP (1) atau Mid2-iRFP (2). Batang skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf nan dijalehan pado (C). Rato-rato persentase ERES nan hanyo manganduang ciek muatan (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP), muatan nan tapisah jo muatan nan batumpuak-tumpuak. Dalam tigo pacobaan mandiri, n=432 pado 54 sel. Bar kasalahan = SD. Uji t indak basandiang duo ikua. *** P = 0,0002. (E) Gambar 3D ERES nan dipiliah dari muatan nan dikarantina nan ditandoi jo (C). Gas1-GFP (hijau) (3) atau Mid2-iRFP (biru) (4) masuak ka ERES (magenta) dari satu sisi dan dibatasi pado daerah ketek di dalam ERES. Kadang-kadang, kaduo jinih muatan masuak ka ERES nan samo (5) dari sisi nan samo dan tabateh pado daerah nan terisolir dalam ERES. Batang skala, 100 nm.
Salanjuiknyo, kami mauji hipotesis baso seramida rantai asil panjang (C26) nan ado dalam membran ER mandorong pangarumpuakan jo panyortiran spesifik Gas1 manjadi ERES selektif. Untuak tujuan iko, kami manggunoan galur ragi nan dimodifikasi GhLag1, di mano duo sintase keramida endogen Lag1 jo Lac1 digantikan jo GhLag1 (homolog Lag1 dari kapas), nan mahasilkan galur ragi jo galur membran sel nan labiah pendek daripado tipe liar (Gambar 3A) (2). Analisis spektrometri massa (MS) manunjuakan baso pado strain tipe liar, 95% dari total seramida adolah seramida barantai nan sangaik panjang (C26), sadangkan pado GhLag1, 85% dari seramida sangaik panjang (C18 jo C16). ), hanyo 2% dari seramida adolah seramida barantai nan sangaik panjang (C26). Walaupun seramida C18 jo C16 adolah seramida utamo nan tadeteksi pado membran GhLag1 salamo ko, analisis MS juo managakan baso jangkar GPI Gas1-GFP nan diekspresikan pado galur GhLag1 manganduang seramida C26, nan sabandiang jo lipid tipe liar. Mutunyo samo (Gambar 3A) (26). Dek karano itu, iko bararti enzim pambuatan ulang keramida Cwh43 sangaik selektif untuak keramida C26, sarupo nan ditunjukkan pado Gambar 26, inyo labiah disukoi mamasuakan jangkar GPI dari sajumlah ketek keramida C26 pado strain GhLag1. S2 (29). Walau baitu, membran sel GhLag1 pado dasarnyo hanyo manganduang seramida C18-C16, sadangkan Gas1-GFP masih manganduang seramida C26. Fakta iko manjadian strain ko sabagai alat nan ideal untuak sacaro khusus manyalasaian masalah panjang rantai asil seramida membran di ER. Peran hipotetis kelas jo panyortiran. Kamudian, kami partamo kali mampalajari kamampuan C26 Gas1-GFP untuak takumpua dalam rumpun di GhLag1 jo alel mutan sec31-1 nan peka jo suhu malalui mikroskop fluoresensi konvensional, di mano hanyo rantai panjang (C18-C16) nan ado pado membran ER Keramida (Gambar 3). Kami mangamati baso pado sec31-1, sabagian gadang Gas1-GFP takonsentrasi dalam rumpun, sadangkan Gas1-GFP pado sec31-1 GhLag1 jo membran ER keramida panjang (C18-C16) panjang tarutamo indak tarumpun dan tasebar pado Dalam saluruah membran ER. Untuak labiah tapeknyo, karano pangrumpukan babasis seramida C26 bakaik arek jo ERES spesifik (Gambar 1), kami salanjuiknyo manyalidiak apokah proses ko mungkin juo malibaikkan fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP manggunoan sistem COPII khusus untuak ekspor ER, nan diatur sacaro aktif dek pambuatan ulang struktural Ted1 pado bagian glikan dari jangkar GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan kamudian dikana dek kompleks p24 reseptor muatan transmembran, nan pado gilirannyo sacaro selektif marekrut Lst1, nan marupoan isoform spesifik dari subunit pangikek muatan COPII utamo Sec24, mambantuak Vesikel COPII nan kayo jo GPI-AP paralu (31). Dek karano itu, kami mambangun mutan ganda nan manggabuangkan panghapusan protein tungga ko (komponen kompleks p24 Emp24, enzim pambuatan ulang GPI-glikan Ted1 jo subunit COPII spesifik Lst1) jo galur mutan sec31-1, dan mampalajarinyo Apokah mungkin untuak mambantuak Gas GFP1-c3). Kami mangamati baso pado sek31-1emp24Δ jo sek31-1ted1Δ, Gas1-GFP tarutamo indak tarumpuak dan tasebar di saluruah membran ER, sarupo nan sabalunnyo dicaliak pado sek31-1 GhLag1, sadangkan pado sek31-1lst1Δ, Gas1-GFP1 Sarupo sek3. Hasia ko manunjuakan baso salain adonyo seramida C26 pado membran ER, pangrumpukan Gas1-GFP juo paralu maikek pado kompleks p24, jo indak mamaralukan rekrutmen Lst1 spesifik. Kamudian, kami manjalajah kamungkinan baso panjang rantai seramida pado membran ER dapek maatur pangikatan Gas1-GFP pado p24. Namun, kami manamukan baso adonyo seramida C18-C16 dalam membran indak mampangaruahi GPI-glikan nan direkonstruksi dek kompleks p24 (Gambar S3 jo S4, A jo B) atau mangikek pado GPI-AP jo maekspor GPI-AP. kamampuan. Marekrut subtipe COPII Lst1 (Gambar S4C). Dek karano itu, pangalompokan C26 nan tagantuang pado seramida indak mamaralukan interaksi protein jo mekanisme protein ekspor ER nan babeda, tapi mandukuang mekanisme panyortiran alternatif nan didorong dek panjang lipid. Kamudian, kami manganalisis apokah panjang rantai asil seramida pado membran ER pantiang untuak klasifikasi efektif Gas1-GFP sabagai ERES selektif. Karano Gas1 pado galur GhLag1 jo seramida barantai pendek maninggaan ER jo masuak ka membran plasma (Gambar S5), kami picayo baso jikok panyortiran didorong dek panjang rantai asil seramida, Gas1 pado galur GhLag1 dapek dialiahkan baliak jo disilang. Barang ERES jo selaput nan samo.
(A) Membran sel GhLag1 tarutamo manganduang seramida C18-C16 nan labiah pendek, sadangkan jangkar GPI Gas1-GFP masih mampunyoi IPC C26 nan samo jo sel tipe liar. Di ateh: analisis panjang rantai asil seramida pado membran sel galur tipe liar (Wt) jo GhLag1p jo spektrometri massa (MS). Data tu mawakili persentase dari total keramida. Rato-rato dari tigo eksperimen mandiri. Bar kasalahan = SD. Uji t indak basandiang duo ikua. **** P <0,0001. Panel bawah: Analisis MS panjang rantai asil IPC nan hadir pado jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) nan dinyatoan pado strain tipe liar jo GhLag1p. Data tu mawakili persentase dari total sinyal IPC. Rato-rato dari limo eksperimen mandiri. Bar kasalahan = SD. Uji t indak basandiang duo ikua. ns, indak paralu. P = 0,9134. (B) Mikrograf fluoresensi dari sel-sel nan mengekspresikan Gas1-GFP nan diinduksi galaktosa diinkubasi pado suhu 37°C dan bantuak fluoresensi turun salamo 37°C salamo sasudah suhu 24°C. Panah putiah: Gugusan Gas1-GFP ER. Panah tabukak: Gas1-GFP nan indak tarumpun tasebar pado saluruah membran ER, manunjuakan pewarnaan cincin inti nan khas ER. Batang skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf nan dijalehan pado (B). Rato-rato persentase sel jo struktur Gas1-GFP nan batitik. Dalam tigo pacobaan mandiri, n≥300 sel. Bar kasalahan = SD. Uji t indak basandiang duo ikua. **** P <0,0001.
Untuak manyalasaian masalah ko sacaro langsuang, kami malakuan visualisasi SCLIM dari Gas1-GFP jo Mid2-iRFP pado GhLag1 jo alel mutan sec31-1 nan peka jo suhu (Gambar 4 jo Film S4). Sasudah ER ditahan pado suhu 37°C dan salanjuiknyo dikaluakan pado suhu 24°C, sabagian gadang Gas1-GFP nan baru disintesis indak tarumpun dan tasebar di saluruah membran ER, sarupo nan diamati jo mikroskop konvensional (Gambar 4, A jo B ). Salain itu, persentase gadang ERES (67%) tamasuak duo jinih muatan nan talatak basamo di dalamnyo (Gambar 4D). Panel 1 jo 2 dari Gambar 4C manunjuakan duo contoh khas ERES jo tumpang tindih Gas1-GFP jo Mid2-GFP. Salain itu, kaduo barang tu direkrut ka dalam ERES nan samo (Gambar 4E, panel 3 jo film S4). Dek karano itu, hasil kami manunjuakan baso panjang rantai asil seramida pado membran ER marupoan penentu pantiang dari agregasi jo klasifikasi protein ER.
Sel GhLag1 nan mangekspresikan sekresi nan diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) jo Mid2-iRFP (TMP, biru) sarato Sec13-mCeri nan diagiah label ERES konstitutif (ERES, magenta) Diinkubasi pado suhu 37°C. Taruih salamo 30 minik, turunkan ka 24°C untuak malapehan sekresi, dan citra jo SCLIM sasudah 20 minik. (A sampai C) Gambar proyeksi 2D nan mawakili (A; batang skala, 1μm) atau gambar balahan sel 3D (B jo C; satuan skala, 0,45μm) dari 10 bagian-z nan ditandoi jo kargo jo ERES. Panel bawah pado (B) jo panel pado (C) manampilkan gambar nan diolah untuak manampilkan hanyo barang nan ado pado ERES (warna magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) jo Mid2-iRFP (biru mudo)]. (C) Panah nan diisi putiah: ERES, barang tumpang tindih. Panah tabukak: ERES hanyo barisi ciek barang. Panel bawah: ERES nan dipiliah mampunyoi barang nan batumpuak (1 jo 2) nan ditandoi jo (C). Batang skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf nan dijalehan pado (C). Dalam unit GhLag1 sek31-1 jo sek31-1, hanyo ciek muatan (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP) nan dimasuakkan, jo persentase rato-rato ERES untuak muatan terisolir jo muatan tumpang tindih. Dalam tigo pacobaan mandiri, n = 432 pado 54 sel (detik31-1) jo n = 430 pado 47 sel (detik31-1 GhLag1). Bar kasalahan = SD. Uji t indak basandiang duo ikua. *** p = 0,0002 (detik 31-1) jo ** p = 0,0031 (detik 31-1). (E) Gambar 3D ERES nan dipiliah jo muatan tumpang tindih (3) nan ditandoi pado (C). Gas1-GFP (hijau) jo Mid2-iRFP (biru) mandakek ka ERES (magenta) dari sisi nan samo jo tingga di daerah nan dibatasi ERES nan samo. Batang skala, 100 nm.
Panalitian ko manyadiokan bukti langsuang in vivo baso kargo protein babasis lipid diklasifikasikan manjadi situs ekspor selektif pado jalur sekresi, jo mangungkapkan pantiangnyo panjang rantai asil untuak selektifitas klasifikasi. Manggunoan teknik mikroskopi nan kuaik jo mutakhir nan disabuik SCLIM, kami manunjuakan Gas1-GFP nan baru disintesis (GPI-AP membran plasma utamo jo porsi lipid keramida rantai asil (C26) nan sangaik panjang) pado ragi ) Daerah-daerah nan tarumpun dalam protein transmbram diskrit nan tasebar malalui ES, nan ado dalam selaput ER (Gambar 1). Salain itu, kaduo jinih barang ko masuak ka ERES nan babeda sacaro selektif (Gambar 2). Panjang rantai asil seramida seluler pado membran bakurang dari C26 manjadi C18-C16, gugusan Gas1-GFP taganggu ka daerah ER nan diskrit, jo Gas1-GFP dialiah rute untuak maninggaan ER jo protein transmembran malalui ERES nan samo (Gambar 3 jo Gambar 3). 4).
Walaupun GPI-AP manggunoan mekanisme protein khusus untuak kalua dari ER, kami manamukan baso pamisahan C26 nan tagantuang pado seramida indak mangandalkan interaksi protein diferensial nan mungkin manyababkan spesialisasi ERES (Gambar S4 jo S5). Sabaliaknyo, temuan kami mandukuang mekanisme klasifikasi alternatif nan didorong dek pangalompokan protein babasis lipid jo pangacualian muatan lain salanjuiknyo. Pangamatan kami manunjuakan baso wilayah atau gugusan Gas1-GFP nan takaik jo ERES tatantu kurang protein nan disekresikan transmembran Mid2-iRFP, nan manunjuakan baso gugusan GPI-AP nan tagantuang pado seramida C26 akan mamudahkan masuaknyo ka dalam ERES nan takaik, dan pado wakatu nan samo, mangacualikan sekresi transmembran tatantu ko. 2). Sabaliaknyo, adonyo seramida C18-C16 pado membran ER indak manyababkan GPI-AP mambantuak daerah atau gugusan, sahinggo inyo indak mangacualian atau manggantian protein nan disekresikan transmembran ka dalam ERES nan samo (Gambar 3 jo 4). . Dek karano itu, kami mangusulkan supayo seramida C26 mandorong pamisahan jo klasifikasi jo mamfasilitasi pangalompokan protein nan takaik jo ERES tatantu.
Baa caronyo mancapai pengelompokan C26 nan tagantuang seramida ko manjadi daerah ER tertentu? Kacenderungan seramida membran untuak tapisah sacaro lateral dapek manyababkan seramida GPI-AP jo C26 mambantuak lipid ketek jo tauruik sacaro instan pado lingkuangan lipid nan labiah indak taratur dari membran ER nan manganduang gliserolipid nan labiah pendek jo indak jenuh. Rumpun nan bakualitas (17, 18). Gugusan samantaro ketek ko dapek labiah lanjuik manyatu manjadi gugusan nan labiah gadang jo labiah stabil sasudah maikek pado kompleks p24 (34). Sasuai jo hal iko, kami manunjuakan baso C26 Gas1-GFP paralu bainteraksi jo kompleks p24 untuak mambantuak gugusan nan tampak nan labiah gadang (Gambar 3). Kompleks p24 adolah oligomer heterozigot nan tadiri dari ampek protein transmembran p24 nan babeda dalam ragi (35), nan manyadiokan pangikatan multivalen, nan dapek manyababkan pangikek silang dari gugusan GPI-AP ketek, sahinggo mahasilkan gugusan Stabil nan labiah gadang (34). Interaksi antaro ektodomain protein GPI-AP dapek juo manyumbang pado agregasinyo, sarupo nan ditunjukkan salamo transportasi Golginyo pado sel epitel mamalia nan tapolarisasi (36). Namun, katiko seramida C18-C16 ado dalam membran ER, katiko kompleks p24 maikek pado Gas1-GFP, gugusan-gugusan tapisah gadang indak akan tabantuak. Mekanisme nan mandasarinyo mungkin tagantuang pado sipaik fisik jo kimia spesifik dari seramida rantai asil panjang. Studi biofisika membran buatan manunjuakan baso walaupun seramida rantai asil panjang (C24) jo pendek (C18-C16) dapek manyababkan pamisahan fase, hanyo seramida rantai asil panjang (C24) nan dapek mandorong Kelengkungan tinggi jo bungkuak film untuak mambantuak baliak film. Malalui saliang rujuak (17, 37, 38). Alah ditunjukkan baso heliks transmembran TMED2, homolog manusia Emp24, sacaro selektif bainteraksi jo sfingomilin nan babasis keramida C18 pado lobus sitoplasma (39). Manggunoan simulasi dinamika molekuler (MD), kami manamukan baso baiak seramida C18 maupun C26 takumpua di sakitar lobus sitoplasma heliks transmembran Emp24, dan inyo mampunyoi piliahan nan sarupo (Gambar S6). Paralu diparatian baso hal iko manunjuakan baso heliks transmembran Emp24 dapek manyababkan pambagian asimetris lipid dalam membran. Iko adolah hasil nan baru-baru ko badasarkan sel mamalia. Simulasi MD nan sarupo juo manunjuakan adonyo lipid eter (40) . Dek karano itu, kami baspekulasi baso seramida C26 pado duo lobus ER26 diperkaya sacaro lokal. Katiko GPI-AP pado lobus luminal langsuang maikek pado p24 multivalen jo akumulasi seramida C26 di sakitar p24 pado lobus sitoplasma, hal iko dapek mandorong agregasi Protein nan mairiangi jo kelengkungan membran nan dihasiakan malalui jari-jari (41), manyababkan GPI-AP juo tapisah manjadi daerah nan tinggi untuak diskrit. daerah-daerah dari selaput ER (42). Laporan sabalunnyo mandukuang mekanisme nan diusulkan (43, 44). Pangikatan multivalen oligolektin, patogen atau antibodi taradok glikosfingolipid babasis keramida (GSL) pado membran plasma mamicu agregasi GSL nan gadang, maningkekan pamisahan fase jo manyababkan deformasi jo internalisasi membran (44). Iwabuchi dll (43) Ditamukan baso pado adonyo rantai asil nan panjang (C24) tapi indak pendek (C16), ligan multivalen nan takaik jo laktosilseramida GSL manginduksi pambentukan gugusan gadang jo invaginasi membran, jo transduksi sinyal nan dimediasi sitoplasma Lyn dek neutral up pado selebaran.
Pado sel epitel mamalia nan tapolarisasi, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) sampai tingkek membran plasma apikal mangandalian pamisahan jo panyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi ko didorong dek oligomerisasi GPI-AP (36), tapi mungkin juo tagantuang pado panjang rantai keramida nan kito tamui pado ragi. Walaupun GPI-AP mamalia mampunyoi jangkar nan babasis lipid eter, jo struktur kimianyo sangaik babeda jo seramida rantai asil nan sangaik panjang, panalitian nan baru-baru ko manamuan baso kaduo lipid mampunyoi sipaik fisik jo kimia Dan fungsi nan sarupo sacaro evolusioner (40). Dek karano itu, bagian lipid eter pado sel mamalia mungkin sarupo jo seramida C26 pado ragi, dan perannyo adolah untuak bakaik jo seramida barantai panjang pado membran untuak mandorong agregasi jo panyortiran GPI-AP. Walaupun kamungkinan iko masih paralu diuji sacaro langsuang, panamuan sabalunnyo mandukuang baso transportasi seramida rantai asil panjang ka tubuah Golgi indak dilakukan dek protein pamindahan sitoplasma, tapi tagantuang pado sintesis jangkar GPI sarupo ragi. Dek karano itu, mekanisme konservatif evolusioner tampaknyo dapek sacaro selektif maangkuik basamo seramida rantai asil nan sangaik panjang jo GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dalam vesikel pangangkutan nan samo.
Pado sistem sel epitel tapolarisasi ragi jo mamalia, agregasi jo pamisahan GPI-AP dari protein membran plasma lainnyo kasadonyo tajadi sabalun mancapai pamukoan sel. Paladino dkk. (48) manamuan baso pado TGN sel epitel mamalia nan tapolarisasi, pangalompokan GPI-AP indak hanyo diparaluan untuak klasifikasi selektif GPI-AP ka membran plasma apikal, tapi juo maatur organisasi pangalompokan GPI-AP jo aktivitas biologisnyo. Permukaan sel. Pado ragi, panalitian ko manunjuakan baso gugusan GPI-AP nan tagantuang pado seramida C26 pado ER dapek maatur organisasi gugusan jo aktivitas fungsional GPI-AP pado membran plasma (24, 49). Konsisten jo model iko, sel GhLag1 alergi jo panghambat GPI atau ubek nan mampangaruahi integritas dindiang sel (28), jo kabutuhan untuak gugusan Gas1-GFP fungsional (49) dari seramida ujuang nan diproyeksikan pado kawinan sel ragi manunjuakan G Kamungkinan konsekuensi fisiologis dari sel hLag1. Kasalahan GPI-AP. Namun, pangujian labiah lanjuik apokah organisasi fungsional pamukoan sel alah diprogram dari ER jo metode panyusunan badasarkan panjang lipid akan manjadi subyek panalitian kami di maso datang.
Strain Sakaromises cerevisiae nan digunoan dalam karya ko dicantumkan pado Tabel S1. Strain SCLIM MMY1583 jo MMY1635 untuak pencitraan sel hiduik dibuek jo latar balakang W303. Strain-strain ko nan mangekspresikan Sec13-mCherry jo tag protein neon dibuek manggunoan metode babasis reaksi barantai polimerase (PCR) jo plasmid pFA6a sabagai cetakan (23). Galur nan mangekspresikan Mid2-iRFP nan diagiah label jo protein neon di bawah kendali promotor GAL1 dibuek sarupo barikuik. Amplifikasi PCR dari urutan iRFP-KanMx dari vektor pKTiRFP-KAN (hadiah dari E. O'Shea, plasmid tambahan nomor 64687; pangidentifikasi sumber daya panalitian (RRID): Sasudah urutan genom Mid2-iRFP dikuekkan jo dikloning ka dalam promotor GAL1, inyo diintegrasikan ka dalam situs Bukan I-Sac I dari plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 nan dihasilkan dilinierkan jo Pst I untuak bagabuang ka dalam lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP diekspresikan di bawah kontrol promotor GAL1 pado plasmid sentromer (CEN), nan dibuek sarupo barikuik. Urutan Gas1-GFP dikuekkan jo PCR dari plasmid pRS416-GFP (hadiah dari L. Popolo) dan dikloning ka situs Xma I-Xho I dari plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah dari C) . Tukang tukang; Nomor plasmid tambahan 51225; 51225; RRID: Tambahan_51225). Plasmid nan dihasilkan diagiah namo pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP juo diekspresikan di bawah kontrol promotor GAL1 dari vektor LEU2 pBEVY-GL, dan konstruksinyo sarupo barikuik. Urutan Axl2-GFP dikuekkan dari plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) jo caro PCR, dan dikloning ka situs Bam HI-Pst I dari vektor LEU2 pBEVY-GL. Plasmid nan dihasiakan diagiah namo pRGS12. Urutan oligonukleotida nan digunoan dalam panalitian ko dicantumkan pado Tabel S2.
Galur ko ditambahi jo 0,2% adenin jo 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] kayo ekstrak ragi protein p (YP) media (1 % ekstrak ragi jo 2% protein ept). (YPR)] atau 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] sabagai sumber karbon, atau dalam media minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi jo 0,5% amonium sulfat) untuak malangkapi asam amino jo basa nan tapek nan diparaluan untuak gizi , Dan manganduang 2% media glukosa sintetis minimal2 (media minim galaktosa sintetis) sabagai sumber karbon.
Untuak pencitraan wakatu nyato, sel mutan sec31-1 nan peka jo suhu nan mangekspresikan konstruk di bawah promotor GAL1 ditumbuahan dalam medium YPR pado suhu 24°C samalam sampai fase log patangahan. Sasudah induksi pado YPG pado suhu 24°C salamo 1 jam, sel-sel diinkubasi pado SG pado suhu 37°C salamo 30 minik, dan kamudian dipindahan ka 24°C untuak malapehan dari blok sekresi. Konkanavalin A digunoan untuak mameloki sel-sel pado slide kaco jo dicitrakan dek SCLIM. SCLIM adolah kombinasi dari mikroskop fluoresensi tabaliak Olympus IX-71 jo lensa minyak bukaan numerik UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), sistem pamindai konfokal cakram baputa nan bakacapatan tinggi jo rasio sinyal-ka-bunyi tinggi (Yokogawa Electric jo sistem khusus), spektrometer citra khusus. (Fotonika Hamamatsu) dapek manyadiokan sistem lensa pabesar jo pabesaran akhia ×266,7 jo kamera parangkat nan digabuangan jo muatan nan mangalikan elektron (Fotonika Hamamatsu) (21). Pangambilan gambar dilakukan jo parangkat lunak khusus (Yokogawa Listrik). Untuak gambar 3D, kami manggunoan aktuator piezolistrik nan dibuek khusus untuak manggetarkan lensa objektif sacaro vertikal, jo mangumpuakan bagian-bagian optik nan bajarak 100 nm dalam satu tumpukan. Gambar stack Z diubah manjadi data voxel 3D, jo fungsi penyebaran titiak teoritis nan digunoan untuak mikroskop konfokal cakram nan baputa digunoan untuak pamrosesan dekonvolusi dek perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Dengan manggunoan perangkat lunak Volocity untuak otomatis ambang batas untuak analisis lokasi basamo, ERES tamasuak muatan diukua. Analisis pindai garih dilakukan jo manggunoan perangkat lunak MetaMorph (Perangkat Molekuler).
Gunoan perangkat lunak GraphPad Prism untuak manantuan signifikansi statistik. Untuak uji t Student duo ikua jo uji analisis varians satu arah (ANOVA) biaso, pabedaan antaro kalompok dianggap mampunyoi dampak nan signifikan pado P <0,05 (*).
Untuak mikroskopi fluoresensi Gas1-GFP, sel-sel fase log ditumbuahan samalam di YPD dan dikumpuakan jo sentrifugasi, dibasuah duo kali jo garam nan disangga fosfat, dan diinkubasi di ateh es salamo paliang indak 15 minik, dan kamudian dilanjutkan di bawah mikroskop sarupo nan dijalehan sabalunnyo (Ceck24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 minyak PH3 CS) nan dilangkoki jo lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu jo parangkat lunak Application Suite X (LAS X) digunoan untuak akuisisi. .
Sampel didenaturasi jo penyangga sampel SDS pado suhu 65°C salamo 10 minik, dan kamudian dipisahkan jo elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Untuak analisis imunoblot, 10 μl sampel dimuek per jalur. Antibodi primer: Gunokan anti-Gas1 poliklonal kelinci pado pangenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci pado pangenceran 1:500, jo anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah dari H. Riezman) pado pangenceran 1:3000. Antibodi monoklonal anti-Pgk1 tikuih digunoan pado pangenceran 1:5000 (hadiah dari J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Imunoglobulin G (IgG) anti-kelinci kambiang konjugasi lobak (HRP) nan digunoan pado pangenceran 1:3000 (Pierce). IgG anti tikuih kambiang nan dikonjugasi jo HRP digunoan pado pangenceran 1:3000 (Tusuak). Zona tanggapan imun diamati jo metode kemiluminesen reagen Pico Barat SuperSignal (Ilmiah Termo Fisher).
Sarupo nan dijalehan pado (31), percobaan imunopresipitasi alami dilakukan pado fraksi ER nan diperkaya. Singkeknyo, cuci sel ragi jo penyangga TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, fenilmetilsulfonil fluorida 1 mM jo campuran panghambat protease) pado suhu 600 nm ( OD600 desensitikal) pado suhu 100 kali optik. Inyo dipacahkan jo manik-manik kaco, dan kamudian puing-puing sel jo manik-manik kaco dikaluakan jo caro sentrifugasi. Supernatan kamudian disentrifugasi pado 17.000 g salamo 15 minik pado suhu 4°C. Pelet diasuspensi ulang dalam TNE dan saponin digitalis ditambahkan sampai konsentrasi akhia 1%. Suspensi diinkubasi salamo 1 jam jo rotasi pado suhu 4°C, dan kamudian komponen nan indak laruik dikaluakan jo sentrifugasi pado 13.000 g pado suhu 4°C salamo 60 minik. Untuak imunopresipitasi Gas1-GFP, partamo kali pra-inkubasi sampel jo manik-manik agarose kosong (ChromoTek) pado suhu 4°C salamo 1 jam, dan kamudian diinkubasi jo GFP-Trap_A (ChromoTek) pado suhu 4°C salamo 3 jam. Manik-manik nan diendapan dicuci limo kali jo TNE nan manganduang digoksigenin 0,2%, dielusi jo penyangga sampel SDS, dipisahkan pado SDS-PAGE, jo dianalisa jo imunoblotting.
Sarupo nan dijalehan pado (31), panantuan pahubungan silang dilakukan pado fraksi ER nan diperkaya. Singkeknyo, fraksi ER nan diperkaya diinkubasi jo ditiobis 0,5 mM (suksinimidil propionat) Reaksi panyambuangan silang dipadamkan jo manambahkan glisin (konsentrasi akhia 50 mM, 5 minik, 20°C).
Sarupo nan dijalehan sabalunnyo (50), analisis MS seramida pado strain tipe liar jo GhLag1 dilakukan. Singkeknyo, sel-sel ditumbuahan sampai fase eksponensial (3 inggo 4 unit OD600/ml) di YPD pado suhu 30°C, jo 25×107 sel dipanen. Metabolismenyo dipadamkan jo asam triklorasetat. Gunoan pelarut ekstraksi [etanol, aia, eter, piridin jo amonium hidroksida 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] jo 1,2 nmol standar internal seramida C17 (860517, lipid kutub Avanti) nan bakualitas). Gunoan reagen monometilamin [metanol, aia, n-butanol jo larutan metilamin (4:3:1:5 v/v)] untuak malakuan hidrolisis alkali ringan dari ekstrak, dan kamudian gunoan n-butanol nan jenuh jo aia untuak maapuih garam. Akhianyo, ekstrak disuspensi baliak dalam pelarut mode positif [kloroform/metanol/aia (2:7:1) + amonium asetat 5 mM] dan disuntikkan ka dalam spektrometer massa. Pamantauan multi-reaksi (MRM) dilakukan untuak identifikasi jo pangukuran molekul sfingolipid. Spektrometer massa kuadrupol tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) dilengkapi jo sumber ion aliran nano robot Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) untuak analisis lipid. Energi tabrakan dioptimalkan untuak satiok kategori keramida. Data MS diperoleh dalam mode positif. Untuak satiok replika biologis, sinyal lipid adolah median dari tigo pangukuran mandiri.
Sarupo nan dijalehan pado (31), sel-sel (800×107) nan mangekspresikan Gas1-GFP diagiah imunopresipitasi alami. Gas1-GFP nan dimurnikan dipisahkan jo SDS-PAGE dan dipindahan ka membran poliviniliden fluorida (PVDF). Protein iko divisualkan jo caro mawarnai PVDF jo amida hitam. Pita Gas1-GFP dipotong dari PVDF dan dibasuah 5 kali jo metanol dan sakali jo aia kelas kromatografi cair-MS (LC-MS). Dengan manginkubasi strip membran jo 500 μl NaOAc 0,3 M (pH 4,0), penyangga jo 500 μl campuran natrium nitrit 1 M nan baru dilaruikkan pado suhu 37°C salamo 3 jam, fraksi lipid dikaluakan dari Gas1-GFP jo inosain fosit dilisis Palapehan inosamin (51) Sasudah itu, strip membran dibasuah ampek kali jo aia kelas LC-MS, dikariangan pado suhu ruangan, jo disimpan dalam atmosfer nitrogen pado suhu -80°C sampai dianalisa. Sabagai kontrol, sampel kosong dari membran PVDF digunoan untuak satiok pacobaan. Lipid nan diekstraksi dari Gas1-GFP kamudian dianalisa jo MS sarupo nan dijalehan (50). Singkeknyo, strip PVDF nan manganduang lipid-GPI disuspensi ulang dalam pelarut cetakan negatif 75μl [kloroform/metanol (1:2) + amonium asetat 5 mM] dan luluih ionisasi elektrosemprotan (ESI)-Analisis MRM/MS dari spesies sfingolipid (TSQ Vantage). Dalam hal iko, data MS didapek dalam mode ion negatif.
Sarupo nan disabuikan sabalunnyo, bagian lipid dari jangkar GPI dipisahkan dari GPI-AP nan diagiah label [3H]-inositol (16). Lipid dipisahkan jo kromatografi lapisan tipih manggunoan sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) dan divisualisasikan jo manggunoan FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel nan mangekspresikan Gas1-GFP (600×107) dibasuah duo kali jo penyangga TNE jo penyangga TNE, dan dipecah jo manik-manik kaco, dan kamudian disentrifugasi untuak maapuih puing-puing sel jo manik-manik kaco. Supernatan kamudian disentrifugasi pado 17.000 g salamo 1 jam pado suhu 4°C. Pelet dibasuah dalam TNE dan diinkubasi jo 1 U PI-PLC (Invitrogen) dalam TNE nan manganduang saponin digitalis 0,2% salamo 1 jam pado suhu 37°C. Sasudah dilakukan jo enzim, membran dikaluakan jo caro sentrifugasi pado 17.000 g pado suhu 4°C salamo 1 jam. Untuak imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan diinkubasi jo GFP-Trap_A (KromoTek) pado suhu 4°C samalam. Gas1-GFP nan dimurnikan nan dipisahkan jo SDS-PAGE diwarnai jo warna biru cemerlang Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP dipotong dari warna abu-abu nan mangaliliangi akuaduk, dan kamudian sasudah alkilasi jo yodoasetamida jo reduksi jo ditiotreitol, pencernaan dalam gel jo tripsin dilakukan. Ekstrak jo kariangkan peptida triptik jo peptida jo GPI-glikan. Peptida nan kariang dilaruikkan dalam 20 μl aia. Suntikkan sabagian (8μl) ka dalam LC. Sabuah kolom oktadesilsilan (ODS) (ODS) digunoan untuak mamisahkan peptida dalam kondisi gradien tatantu. Fase nan bapindah adolah pelarut A (0,08% asam formik) jo pelarut B (0,15% asam formik dalam 80% asetonitril). Sistem HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) digunoan untuak maeluasi kolom jo pelarut A dalam wakatu 55 minik jo laju aliran 50 μl min-1 salamo 5 minik, dan kamudian konsentrasi pelarut B ditingkekkan manjadi 40%. , Amerika Serikat). Eluat taruih dimasuakkan ka dalam sumber ion ESI, dan peptida triptik jo peptida jo GPI-glikan dianalisa jo LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa perangkap-orbitrap ion linier hibrida; Ilmiah Thermo Fisher). Dalam panyadioan MS, tegangan sumber kapiler diatur pado 4,5 kV, jo suhu kapiler pamindahan dijago pado 300°C. Tegangan kapiler jo tegangan lensa tabuang diatur masiang-masiang 15 V jo 50 V. Data MS diperoleh dalam mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagian per juta) dalam rentang massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. disosiasi nan diakibaikan dek tabrakan (CID)].
Simulasi MD dilakukan jo manggunoan perangkat lunak GROMACS (52) jo medan gaya MARTINI 2 (53-55). Pambangun Membran GUI CHARMM (56, 57) kamudian digunoan untuak mambangun lapisan ganda nan manganduang dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) jo Cer C18 atau DOPC jo Cer C26. Topologi jo koordinat Cer C26 diperoleh dari DXCE jo caro mangaluaan manik-manik tambahan dari ikua sfingosin. Gunokan proses nan dijalehan di bawah untuak maimbangi lapisan ganda dan manjalankannyo, kamudian gunokan koordinat tarakhir dari sistem untuak mambangun sistem nan manganduang Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 sampai 193) dibangun sabagai heliks α manggunoan struktur molekuler alat MD (VMD) visual (58). Kudian, sasudah mangaluaan lipid nan batumpuak, protein dibutiran sacaro kasa jo dimasuakkan ka dalam lapisan ganda manggunoan GUI CHARMM. Sistem tarakhia barisi 1202 DOPC jo 302 Cer C26 atau 1197 DOPC jo 295 Cer C18 jo Emp24. Ionkan sistem sampai konsentrasi 0,150M. Ampek ulangan mandiri dibuek untuak duo komposisi lapisan ganda.
Lapisan ganda lipid diimbangi manggunoan proses GUI CHARMM, nan malibaikkan maminimalikan jo kamudian manyaimbangkan 405.000 langkah, di mano batasan posisi sacaro baansua-ansua bakurang jo dihilangkan, jo langkah wakatu ditambah dari 0,005 ps manjadi 0,02 ps. Sasudah diimbangi, inyo manghasilkan 6 μs jo langkah wakatu 0,02 ps. Sasudah mamasuakan Emp24, gunoan proses GUI CHARMM nan samo untuak maminimalikan dan maimbangi sistem, dan kamudian bajalan salamo 8 s dalam produksi.
Untuak sadoalah sistem, salamo proses panyaimbangan, takanan dikontrol dek barostat Berendsen (59), dan salamo proses produksi, takanan dikontrol dek barostat Parrinello-Rahman (60). Dalam sadoalah kasus, takanan rato-rato adolah 1 bar jo skema panggabungan takanan semi-isotropik digunoan. Dalam proses kasaimbangan jo produksi, termostat (61) jo kalibrasi ulang kacapatan digunoan untuak manggabuangan suhu partikel protein, lipid jo pelarut masiang-masiang. Salamo saluruah operasi, suhu nan ditargetkan adolah 310K. Interaksi nan indak bakaik dihituang jo manghasilkan daftar pasangan manggunoan skema Verlet jo toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb dihituang jo manggunoan medan reaksi jo jarak pamotongan 1,1 nm. Istilah Vander Waals manggunoan skema pamotongan jo jarak pamotongan 1,1 nm, jo ​​skema pamotongan Verlet digunoan untuak potensi panyimpangan (62).
Manggunoan VMD, panjang galombang pamotongan antaro manik-manik fosfat DOPC atau manik-manik keramida AM1 jo protein adolah 0,7 nm, jo ​​jumlah lipid nan bainteraksi jo protein dihituang. Manuruik rumus barikuik, hituang faktor habis-pangayaan (DE) sarupo pado (63): Faktor DE = (jumlah total lipid dalam protein 0,7) dalam protein 0,7 (jumlah Cer dalam total lipid) .
Nilai nan dilaporkan didapek sabagai rato-rato, dan bar kasalahan adolah ampek salinan mandiri dari SE. Signifikansi statistik faktor DE dihituang jo uji t [(rato-rato faktorDE-1)/SE]. Hituang nilai P dari distribusi satu ikua.
Alat GROMACS digunoan untuak mahituang peta kapadekan lateral 2D dari sistem nan manganduang Emp24 dalam 250 ns tarakhia dari jajak. Untuak mandapekkan peta pangayaan/panghabisan seramida, peta kapadekan Cer dibagi jo jumlah peta Cer jo DOPC, dan kamudian dibagi jo konsentrasi Cer dalam tubuah. Skala peta warna nan samo nan digunokan.
Untuak bahan tambahan untuak artikel ko, silakan caliak http://advances.sciencemag.org/cgi.
Iko adolah artikel akses tabukak nan didistribusikan di bawah syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, nan mamungkinkan panggunoan, distribusi jo reproduksi dalam media apo sajo, asalkan panggunoan akhia bukan untuak kauntuangan komersial dan premisnyo baso karya aslinyo batua. Reperensi.
Catatan: Kami hanyo mamintak Sanak untuak manyadiokan alamat email Sanak supayo urang nan Sanak rekomendasikan ka laman tu tahu baso Sanak nio inyo mancaliak email tu dan baso itu bukan spam. Kami indak akan manangkap alamat email apopun.
Pertanyaan ko digunoan untuak mauji apokah Sanak adolah pangunjuang dan mancagah pangiriman spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Logilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan wakatu nyato 3D resolusi tinggi mangungkapkan pantiangnyo panjang rantai keramida untuak panyortiran protein di situs kalua selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Logilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan wakatu nyato 3D resolusi tinggi mangungkapkan pantiangnyo panjang rantai keramida untuak panyortiran protein di situs kalua selektif.
©2020 Asosiasi Amerika untuak Kamajuan Ilmu Pengetahuan. sagalo hak dilindungi. AAAS adolah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kamajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.