Kini *Alamat kini: Köln 50931, Jerman, Penelitian Klaster Keunggulan Köln tantang Tanggapan Stres Seluler dalam Panyakik nan Takaik jo Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi panyakik mitokondria dianggap indak dapek dibaliakkan karano plastisitas metabolisme neuron tabateh, tapi efek disfungsi mitokondria pado otonomi sel metabolisme neuron dalam tubuah kurang dipahami. Di siko, kami mampakenalkan proteom spesifik sel neuron Purkinje jo defisiensi OXPHOS nan progresif nan disababkan dek dinamika fusi mitokondria nan taganggu. Kami manamuan baso disfungsi mitokondria mamicu parubahan mandalam di bidang proteomik, nan akhianyo mangarah pado aktivasi urutan program metabolisme nan tapek sabalun kamatian sel. Indak disangko-sangko, kami manantukan induksi nan jaleh dari piruvat karboksilase (PCx) jo peroksidase lainnyo nan takaik jo manambah bahan parantara siklus TCA. Pangambatan PCx mampaburuak stres oksidatif jo degenerasi saraf, nan manunjuakan baso aterosklerosis mampunyoi efek palinduang pado neuron nan kurang OXPHOS. Pamulihan fusi mitokondria pado neuron nan alah rusak sacaro terminal sapanuahnyo mambaleh ciri-ciri metabolisme ko, sahinggo mancegah kamatian sel. Tamuan kami mangidentifikasi jalur nan alun dikatahui sabalunnyo nan mambarikan katahanan taradok disfungsi mitokondria jo manunjuakan baso neurodegenerasi dapek dibaliakkan bahkan pado tahap akhia panyakik.
Peran sentral mitokondria dalam manjago metabolisme energi saraf ditakankan dek gejala saraf nan luas nan takaik jo panyakik mitokondria manusia. Sabagian gadang panyakik ko disababkan dek mutasi gen nan mangatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) atau parusakan gen nan takaik jo dinamika mitokondria, nan sacaro indak langsuang mampangaruahi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Karajo pado model hewan alah manunjuakan baso sabagai tanggapan taradok disfungsi mitokondria pado jaringan sakitarnyo, jalur metabolisme konservatif (5-7) dapek diaktifkan, sahinggo mambarikan wawasan pantiang tantang patogenesis panyakik-panyakik nan kompleks ko. Sabaliaknyo, pamahaman kito tantang parubahan metabolisme dari jinih sel tatantu nan disababkan dek kagagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria utak adolah mandasar (8), nan manakankan paralunyo untuak maidentifikasi sasaran terapi nan dapek digunoan untuak mancagah atau mancagah panyakik. Mancegah panyakik saraf (9). Kurangnyo informasi adolah kanyataan baso sel saraf dianggap sacaro laweh mampunyoi fleksibilitas metabolisme nan sangaik tabateh dibandiangkan jo jinih sel jaringan sakitarnyo (10). Maingek baso sel-sel ko mamainkan peran sentral dalam mangkoordinasikan pasokan metabolit ka neuron untuak mandorong transmisi sinaptik jo mananggapi kondisi luko jo panyakik, kamampuan untuak manyasuaian metabolisme sel jo kondisi jaringan utak nan manantang ampia tabateh pado sel glial (11-14). Salain itu, heterogenitas seluler nan melekat pado jaringan utak sabagian gadang mahalangi kajian tantang parubahan metabolisme nan tajadi pado subkalompok saraf tatantu. Akibaiknyo, saketek nan dikatahui tantang akibaik seluler jo metabolisme nan tapek dari disfungsi mitokondria pado neuron.
Untuak mamahami akibaik metabolisme dari disfungsi mitokondria, kami mangisolasi neuron Purkinje (PN) pado tahap neurodegenerasi nan babeda nan disababkan dek parusakan fusi membran lua mitokondria (Mfn2). Walaupun mutasi Mfn2 pado manusia takaik jo bantuak neuropati sensorik motorik turun tamurun nan dikenal sabagai Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), parusakan kondisional Mfn2 pado tikuih marupoan induksi disfungsi oksidasi Fosforilasi (OXthoPHOS) nan diakui jo baiak. Babagai subtipe saraf (16-19) jo fenotipe saraf nan dihasilkan diiriangi jo gejala saraf nan progresif, sarupo gangguan garak (18, 19) atau ataksia otak ketek (16). Dengan manggunoan kombinasi metode proteomik, metabolomik, pencitraan, jo virusologi bebas label, kami manunjuakan baso neurodegenerasi progresif sangaik manginduksi piruvat karboksilase (PCx) jo faktor lain nan talibaik dalam arteriosklerosis PN dalam vivo Ekspresi enzim. Untuak mamverifikasi relevansi panamuan ko, kami sacaro khusus maatur turun ekspresi PCx pado PN nan kakurangan Mfn2, jo manamuan baso operasi ko mampaburuak stres oksidatif jo mampacapek degenerasi saraf, sahinggo mambuktikan baso azoospermia mambarikan kamatian sel Kamampuan beradaptasi metabolisme. Ekspresi barek MFN2 dapek sapanuahnyo manyalamaikan degenerasi terminal PN jo defisiensi OXPHOS barek, konsumsi masif DNA mitokondria, jo tampaknyo jaringan mitokondria nan putuih, nan labiah lanjuik manakankan baso bantuak degenerasi saraf ko bahkan dapek pulih pado tahap panyakik sel lanjutan 2019.
Untuak mamvisualisasikan mitokondria pado PN knockout Mfn2, kami manggunoan galur tikuih nan mamungkinkan mitokondria nan tagantuang pado Cre untuak manargetakan protein neon kuniang (YFP) (mtYFP) (20) ekspresi Cre jo mamareso morfologi mitokondria dalam vivo. Kami manamuan baso parusakan gen Mfn2 pado PN akan manyababkan pambagian jaringan mitokondria sacaro batahap (Gambar S1A), dan parubahan paliang awal ditamukan pado umua 3 minggu. Sabaliaknyo, degenerasi substansial lapisan sel PN, sarupo nan dibuktikan jo kahilangan imunowarna Calbindin, indak dimulai sampai umua 12 minggu (Gambar 1, A jo B). Katidakcocokan wakatu antaro parubahan morfologi mitokondria paliang awal jo dimulainyo kamatian neuron nan tampak mandorong kami untuak manyalidiak parubahan metabolisme nan dipicu dek disfungsi mitokondria sabalun kamatian sel. Kami mangambangkan strategi babasis panyortiran sel nan diaktifkan jo fluoresensi (FACS) untuak mangisolasi PN nan mangekspresikan YFP (YFP +) (Gambar 1C), jo pado tikuih kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- baranti-loxP: : L7-cre), salanjuiknyo disabuik sabagai CT1BRL (Gambar). Optimalisasi strategi gerbang badasarkan intensitas relatif sinyal YFP mamungkinkan kito untuak mamurnikan tubuah YFP + (YFPtinggi) dari PN dari non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) atau pacahan akson / dendritik neon nan diduga (Gambar S1D, kiri). Untuak mamverifikasi identitas populasi nan diklasifikasikan, kami malakuan proteomik LFQ dan kamudian analisis komponen utamo, dan manamukan baso ado pamisahan nan jaleh antaro sel YFPhigh jo YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh manunjuakan pangayaan bersih dari panando PNs nan dikatahui (yaitu Calb1, Pcp2, Grid2 jo Itpr3) (21, 22), tapi indak ado pangayaan protein nan umum diekspresikan pado neuron atau jinih sel lainnyo (Gambar 1D) ). Pabandiangan antaro sampel pado sel YFPhigh nan diklasifikasikan nan dikumpuakan dalam pacobaan mandiri manunjuakan koefisien korelasi> 0,9, nan manunjuakan kamungkinan direproduksi nan baiak antaro replika biologis (Gambar S1E). Singkatnyo, data ko mamvalidasi rencana kami untuak isolasi akut dan spesifik dari PN nan layak. Karano sistem panggerak L7-cre nan digunoan manginduksi rekombinasi mosaik pado minggu partamo sasudah malahiakan (23), kami mulai mambunuah tikuih dari CTRL jo kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-baranti-loxP :: L7-cre) Mangumpuakan neuron. Sasudah rekombinasi salasai, disabuik Mfn2cKO pado umua 4 minggu. Sabagai titiak akhia, kami mamiliah umua 8 minggu katiko lapisan PN masih utuh walaupun ado pacahan mitokondria nan jaleh (Gambar 1B jo Gambar S1A). Sacaro kasaluruahan, kami mangukua sabanyak 3013 protein, di mano sakitar 22% didasarkan pado anotasi MitoCarta 2.0 badasarkan proteom mitokondria sabagai mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial nan dilakukan pado minggu ka-8 manunjuakan baso hanyo 10,5% dari saluruah protein mampunyoi parubahan nan signifikan (Gambar 1F jo Gambar S1F), di mano 195 protein diatur ka bawah jo 120 protein diatur ka ateh (Gambar 1F). Paralu diparatian baso "analisis jalur inovatif" dari himpunan data ko manunjuakan baso gen nan diekspresikan sacaro babeda tarutamo tamasuak dalam himpunan jalur metabolisme tatantu nan dibatasi (Gambar 1G). Nan menarik, walaupun pangaturan turun jalur nan takaik jo OXPHOS jo sinyal kalsium managakan induksi disfungsi mitokondria pado PN nan kakurangan fusi, kategori lain nan tarutamo malibaikkan metabolisme asam amino sacaro signifikan diatur ka ateh, nan sasuai jo metabolisme mitokondria P nan tajadi. Kabel ulang tu konsisten. indak bafungsi.
(A) Foto konfokal perwakilan bagian otak kecil tikuih CTRL jo Mfn2cKO nan manunjuakan kahilangan PN nan progresif (kalbindin, abu-abu); intinyo dikontrak jo DAPI. (B) Kuantifikasi dari (A) (analisis varians satu arah, ***P<0,001; n = 4 sampai 6 lingkaran dari tigo tikuih). (C) Alur karajo nan dicubo. (D) Distribusi peta paneh dari panando khusus untuak Purkinje (atas) jo jinih sel lainnyo (tangah). (E) Diagram Venn nan manunjuakan jumlah protein mitokondria nan diidentifikasi pado PN nan diklasifikasikan. (F) Plot gunuang barapi protein nan diekspresikan sacaro babeda pado neuron Mfn2cKO pado 8 minggu (nilai potong signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas manunjuakan limo jalur pangaturan naiak (merah) jo pangaturan turun (biru) nan paliang pantiang pado PN Mfn2cKO nan diklasifikasikan sabagai 8 minggu. Tingkek ekspresi rato-rato satiok protein nan tadeteksi ditunjuakan. Peta paneh skala abu-abu: nilai P nan disasuaikan. ns, indak paralu.
Data proteomik manunjuakan baso ekspresi protein kompleks I, III, jo IV manurun sacaro baansua-ansua. Kompleks I, III, jo IV kasadonyo manganduang subunit nan dikodekan mtDNA esensial, sadangkan kompleks II, nan hanyo dikodekan inti, pado dasarnyo indak kanai pangaruah (Gambar 2A jo Gambar S2A). . Sasuai jo hasil proteomik, imunohistokimia bagian jaringan otak kecil manunjuakan baso tingkek subunit MTCO1 (subunit sitokrom C oksidase mitokondria 1) kompleks IV pado PN manurun sacaro baansua-ansua (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 nan dikodekan mtDNA bakurang sacaro signifikan (Gambar S2A), sadangkan tingkek kaadaan mantap subunit sintase ATP nan dikodekan inti tatap indak barubah, nan konsisten jo kompleks F1 subrakitan sintase ATP nan stabil nan dikatahui katiko ekspresi mtDNA stabil. Pambentukannyo sasuai. Mamotong (7). Evaluasi tingkek mtDNA pado PN Mfn2cKO nan diuruik jo reaksi barantai polimerase wakatu nyato (qPCR) mamastian panurunan jumlah salinan mtDNA sacaro batahap. Dibandiangkan jo kalompok kontrol, pado umua 8 minggu, hanyo sakitar 20% dari kadar mtDNA nan dipertahankan (Gambar 2C). Sasuai jo hasil iko, pawarnaan mikroskopi konfokal PN Mfn2cKO untuak mandeteksi DNA manunjuakan konsumsi nukleotida mitokondria nan tagantuang pado wakatu (Gambar 2D). Kami manamukan baso hanyo babarapo kandidat nan talibaik dalam degradasi protein mitokondria jo tanggapan stres nan diatur ka ateh, tamasuak Lonp1, Afg3l2 jo Clpx, jo faktor panggabungan kompleks OXPHOS. Indak ado parubahan nan signifikan pado kadar protein nan talibaik dalam apoptosis nan tadeteksi (Gambar S2B). Baitu juo, kami manamukan baso saluran mitokondria jo retikulum endoplasma nan talibaik dalam pangangkutan kalsium hanyo mampunyoi parubahan ketek (Gambar S2C). Salain itu, evaluasi protein nan takaik jo autofagi indak manamukan parubahan nan signifikan, nan sasuai jo induksi nan tampak dari autofagosom nan diamati dalam vivo jo imunohistokimia jo mikroskopi elektron (Gambar S3). Namun, disfungsi OXPHOS nan progresif pado PN diiriangi jo parubahan mitokondria ultrastruktur nan jaleh. Gugusan mitokondria dapek dicaliak pado tubuah sel jo pohon dendritik PN Mfn2cKO nan baumua 5 jo 8 minggu, jo struktur membran dalam alah mangalami parubahan nan mandalam (Gambar S4, A jo B). Sasuai jo parubahan ultrastruktur ko jo panurunan mtDNA nan signifikan, analisis irisan otak otak akut jo ester metil tetrametilrodamin (TMRM) manunjuakan baso potensi membran mitokondria pado PN Mfn2cKO manurun sacaro signifikan (Gambar S4C).
(A) Analisis pajalanan wakatu tingkek ekspresi kompleks OXPHOS. Hanyo maanggap protein jo P<0,05 pado 8 minggu (ANOVA duo arah). Garih titiak-titik: Indak ado panyasuaian dibandiangkan jo CTRL. (B) Kiri: Contoh bagian otak ketek nan diagiah label jo antibodi anti-MTCO1 (batang skala, 20 μm). Daerah nan diduduaki dek badan sel Purkinje tatutuik dek warna kuniang. Kanan: Kuantifikasi kadar MTCO1 (analisis varians satu arah; n = 7 sampai 20 sel nan dianalisa dari tigo tikuih). (C) Analisis qPCR dari jumlah salinan mtDNA pado PN nan diuruik (analisis varians satu arah; n = 3 sampai 7 tikuih). (D) Kiri: Contoh irisan otak ketek nan diagiah label jo antibodi anti-DNA (batang skala, 20 μm). Daerah nan diduduaki dek badan sel Purkinje tatutuik dek warna kuniang. Kanan: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians satu arah; n = 5 sampai 9 sel dari tigo tikuih). (E) Contoh bagian otak kecil akut nan manunjuakan sel mitoYFP + Purkinje (panah) dalam rekaman penjepit tambalan saluruah sel. (F) Pangukuran kurva IV. (G) Rekaman perwakilan dari suntikan arus depolarisasi pado sel Purkinje CTRL jo Mfn2cKO. Jajak ateh: Nadi partamo nan mamicu AP. Jajak bawah: Frekuensi AP maksimal. (H) Pangukuran masukan spontan pascasinaptik (sPSP). Jajak rekaman nan mawakili jo rasio zoomnyo ditunjuakan pado (I). Analisis varians satu arah dianalisis n = 5 sampai 20 sel dari tigo tikuih. Data dinyatoan sabagai rato-rato±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Jajak perwakilan AP spontan nan dicatat manggunoan mode penjepit tambalan nan balubang. Jajak ateh: Frekuensi AP maksimal. Jajak bawah: zoom dari AP tungga. (K) Ukua frekuensi AP rato-rato jo maksimum manuruik (J). uji Mann-Witney; n = 5 sel dianalisa dari ampek tikuih. Data dinyatoan sabagai rato-rato±SEM; indak pantiang.
Karusakan OXPHOS nan jaleh tadeteksi pado PN Mfn2cKO nan baumua 8 minggu, nan manunjuakan baso fungsi fisiologis neuron sangaik indak normal. Dek karano itu, kami manganalisis karakteristik listrik pasif neuron nan kakurangan OXPHOS pado 4 inggo 5 minggu jo 7 inggo 8 minggu jo malakukan rekaman penjepit tambalan saluruah sel pado irisan otak kecil akut (Gambar 2E). Indak disangko-sangko, rato-rato potensi membran istirahat jo resistensi masuak neuron Mfn2cKO sarupo jo kontrol, walaupun ado pabedaan haluih antaro sel (Tabel 1). Baitu juo pado umua 4 inggo 5 minggu, indak ado parubahan signifikan pado hubungan arus-tegangan (kurva IV) nan ditamukan (Gambar 2F). Namun, indak ado neuron Mfn2cKO baumua 7 inggo 8 minggu nan salamat dari rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), nan manunjuakan baso ado sensitivitas nan jaleh taradok potensi hiperpolarisasi pado tahap akhia ko. Sabaliaknyo, pado neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi nan manyababkan debit potensial aksi berulang (AP) ditoleransi jo baiak, nan manunjuakan baso pola debitnyo sacaro kasaluruahan indak babeda sacaro signifikan jo neuron kontrol nan baumua 8 minggu (Tabel 1 jo Gambar 2G). Baitu juo frekuensi jo amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSC) sabandiang jo kalompok kontrol, jo frekuensi kajadian maningkek dari 4 minggu manjadi 5 minggu manjadi 7 minggu manjadi 8 minggu jo paningkekan nan sarupo (Gambar 2, H jo I). Maso pamatangan sinaptik pado PN (25). Hasia nan sarupo didapek sasudah tambalan PNs nan balubang. Konfigurasi iko mancegah kamungkinan kompensasi cacat ATP seluler, sarupo nan mungkin tajadi pado rekaman penjepit tambalan saluruah sel. Sacaro khusus, potensi membran istirahat jo frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO indak kanai pangaruah (Gambar 2, J jo K). Singkatnyo, hasil iko manunjuakan baso PN jo disfungsi OXPHOS nan jaleh dapek maadopsi pola debit frekuensi tinggi jo baiak, manunjuakan baso ado mekanisme kompensasi nan mamungkinkannyo untuak mampatahankan tanggapan elektrofisiologis nan ampia normal.
Data dinyatoan sabagai rato-rato ± SEM (analisis varians satu arah, uji pambandiangan ganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomor satuan ditunjuakan jo kurung.
Kami barangkek untuak manyalidiak apokah ado kategori dalam dataset proteomik (Gambar 1G) mancakup jalur nan dapek manantang defisiensi OXPHOS nan barek, sahinggo manjalehan baa mangko PN nan kanai dapek mampatahankan elektrofisiologi nan ampia normal (Gambar 2, E sampai K). . Analisis proteomik manunjuakan baso enzim nan talibaik dalam katabolisme asam amino rantai bacabang (BCAA) sacaro signifikan diatur ka ateh (Gambar 3A jo Gambar S5A), jo produk akhia asetil-KoA (CoA) atau suksinil KoA dapek malangkapi trikarboksilat pado akteriosklerosis arteriosklerosis). Kami manamukan baso kanduangan transaminase BCAA 1 (BCAT1) jo BCAT2 kaduonyo maningkek. Mareka mangatalisis langkah partamo katabolisme BCAA jo manghasilkan glutamat dari α-ketoglutarat (26). Sagalo subunit nan mambantuak kompleks asam keto dehidrogenase (BCKD) rantai bacabang diatur ka ateh (kompleks ko mangatalisis dekarboksilasi barikuiknyo jo indak dapek dibaliakkan dari rangka karbon BCAA nan dihasilkan) (Gambar 3A jo Gambar S5A). Namun, indak ado parubahan nan jaleh pado BCAA itu sandiri nan ditamukan pado PN nan diuruik, nan mungkin dek paningkekan pangambilan seluler dari asam amino esensial ko atau panggunoan sumber lain (glukosa atau asam laktat) untuak malangkapi siklus TCA (Gambar S5B). PN nan kurang OXPHOS juo manunjuakan paningkekan panguraian glutamin jo aktivitas transaminasi pado umua 8 minggu, nan dapek dicaminkan dek pangaturan naiak enzim mitokondria glutaminase (GLS) jo glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A jo C). Paralu diparatian baso pangaturan naiak GLS tabateh pado isoform glutaminase C nan disambung (GLS-GAC) (parubahan Mfn2cKO/CTRL kiro-kiro 4,5 kali lipek, P = 0,05), jo pangaturan naiaknyo nan spesifik pado jaringan biokanker Dapek mandukuang mitokondria. (27).
(A) Peta paneh manunjuakan parubahan lipatan kadar protein untuak rute nan ditantukan pado 8 minggu. (B) Contoh irisan otak ketek nan diagiah label jo antibodi anti-PCx (batang skala, 20 μm). Panah kuniang manunjuak ka badan sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein pajalanan wakatu nan diidentifikasi sabagai kandidat pantiang untuak aterosklerosis (uji t ganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikuih). (D) Di ateh: Diagram skematik nan manunjuakan caro nan babeda untuak mamasuakan karbon nan diagiah label nan takanduang dalam [1-13C] palacak piruvat (yaitu, malalui PDH atau rute trans-arteri). Bawah: Bagan biola manunjuakan persentase karbon nan diagiah label tungga (M1) nan diubah manjadi asam aspartat, asam sitrat jo asam malat sasudah malabeli irisan otak kecil akut jo [1-13C]piruvat (uji t basandiang; ** P <0,01). (E) Analisis sejarah wakatu nan komprehensif dari jalur nan ditunjukkan. Hanyo maanggap protein jo P<0,05 pado 8 minggu . Garih putus-putus: indak ado nilai panyasuaian (analisis varians duo arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data dinyatoan sabagai rato-rato±SEM.
Dalam analisis kami, katabolisme BCAA alah manjadi salah satu jalur kunci pangaturan naiak. Fakta iko sangaik manunjuakan baso volume ventilasi nan masuak ka siklus TCA mungkin barubah pado PN nan kurang OXPHOS. Hal iko mungkin mawakili bantuak utamo dari pangawaran ulang metabolisme saraf, nan mungkin mampunyoi dampak langsuang pado fisiologi saraf jo kalangsuangan hiduik salamo pamaliharoan disfungsi OXPHOS nan barek. Sasuai jo hipotesis iko, kami manamukan baso enzim anti-aterosklerotik utamo PCx diatur ka ateh (Mfn2cKO/CTRL barubah kiro-kiro 1,5 kali; Gambar 3A), nan mangatalisis konversi piruvat manjadi oksaloasetat (28), nan dipicayoi ado dalam utak, 30). Sasuai jo hasil proteomik, mikroskopi konfokal manunjuakan baso ekspresi PCx maningkek sacaro spesifik jo signifikan pado PN nan kakurangan OXPHOS, sadangkan reaktivitas PCx tarutamo dibatasi pado sel glial Bergmann nan badakek-an dari kontrol (Gambar 3B). Untuak mauji sacaro fungsional upregulasi PCx nan diamati, kami maubek irisan otak kecil akut jo [1-13C] palacak piruvat. Katiko piruvat dioksidasi dek piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopnyo ilang , Tapi dimasuakkan ka dalam bahan parantara siklus TCA katiko piruvat dimetabolisme dek reaksi pambuluah darah (Gambar 3D). Untuak mandukuang data proteomik kami, kami mangamati sajumlah gadang panando dari palacak ko pado asam aspartat dari irisan Mfn2cKO, sadangkan asam sitrat jo asam malat juo mampunyoi tren sadang, walaupun indak signifikan (Gambar 3D).
Pado neuron dopamin tikuih MitoPark jo disfungsi mitokondria nan disababkan dek neuron dopamin sacaro khusus marusak gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx juo diatur sacaro signifikan (31), nan manunjuakan baso asam aseton nan tajadi di OKSFOS nan ado di badan. Paralu diparatian baso alah ditamukan baso enzim unik (32-34) nan mungkin diekspresikan pado neuron nan mungkin takaik jo arteriosklerosis sacaro signifikan diatur ka ateh pado PN nan kurang OXPHOS, sarupo propionil-KoA karboksilase (PCC-A), Malonil-Koa mitokilKoA maubah manjadi enzim 3 (ME3), nan peran utamonyo adolah untuak mambaliakan piruvat dari malat (Gambar 3, A jo C) (33, 35). Salain itu, kami manamukan paningkekan signifikan pado enzim Pdk3, nan mafosforilasi jo sacaro iko manaktifkan PDH (36), samantaro indak ado parubahan nan tadeteksi pado enzim Pdp1 nan maaktifkan PDH atau kompleks enzim PDH itu surang (Gambar 3A). Sacaro konsisten, pado PN Mern2cKO, fosforilasi subunit α1 subunit α (PDHE1α) dari komponen piruvat dehidrogenase E1 dari kompleks PDH pado Ser293 (nan dikatahui untuak mangambati aktivitas enzim PDH) ditingkatkan ( Gambar S6C ) (Gambar S6C). Piruvat indak punyo akses pambuluah darah.
Akhianyo, kami manamukan baso jalur super biosintesis serin jo glisin, siklus mitokondria folat (1C) nan takaik jo biosintesis prolin (Gambar 1G jo Gambar S5C) sadonyo sacaro signifikan diatur ka ateh, manuruik laporan, salamo proses aktivasi. Jaringan sakitarnyo diaktifkan jo disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal nan mandukuang data proteomik ko manunjuakan baso pado PN jo OXPHOS nan hilang, irisan otak tikuih baumua 8 minggu diagiah serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci dari siklus folat mitokondria. Tanggapan imun nan signifikan (Gambar S5D). Pado 13 irisan otak kecil akut nan diinkubasi jo glukosa CU, eksperimen palacakan metabolisme labiah lanjuik mamastian pangaturan naiak biosintesis serin jo prolin, nan manunjuakan baso fluks isoform karbon manjadi serin jo prolin maningkek (Gambar S5E). Karano reaksi nan dipromosikan dek GLS jo GPT2 batangguang jawab untuak sintesis glutamat dari glutamin jo transaminasi antaro glutamat jo α-ketoglutarat, upregulasinyo manunjuakan baso neuron nan kakurangan OXPHOS mampunyoi paningkekan pamintaan untuak glutamat , Hal iko mungkin batujuan untuak mampatahankan paningkekan biosintesis proC (Gambar5). Babeda jo parubahan iko, analisis proteomik astrosit otak ketek dari tikuih Mfn2cKO spesifik PN manunjuakan baso jalur iko (tamasuak sadoalah antiperoksidase) indak barubah sacaro signifikan dalam ekspresi, sahinggo manunjuakan Pangalihan metabolisme ko selektif untuak PN nan tadegradasi ka D (Gambar S6, G).
Singkatnyo, analisis-analisis ko mangungkapkan pola aktivasi temporal jalur metabolisme tatantu pado PN nan babeda sacaro signifikan. Walaupun fungsi mitokondria neuron nan indak normal dapek manyababkan aterosklerosis awal jo pambuatan ulang 1C (Gambar 3E jo Gambar S5C), dan bahkan parubahan nan dapek diprediksi pado ekspresi kompleks I jo IV, parubahan sintesis serin de novo hanyo Itu hanyo manjadi nyato pado tahap akhia. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E jo Gambar S5C). Tamuan ko mandefinisian proses baurutan di mano mitokondria (siklus 1C) jo sitoplasma (biosintesis serin) nan diinduksi dek stres mananggapi sacaro sinergis jo paningkekan aterosklerosis dalam siklus TCA untuak mambantuak baliak metabolisme saraf.
PN nan kakurangan OXPHOS baumua 8 minggu dapek mampatahankan aktivitas eksitasi frekuensi tinggi jo manjalani rekoneksi metabolisme nan signifikan untuak maimbangi disfungsi mitokondria. Panamuan ko maningkekan kamungkinan nan manarik baso bahkan pado saat iko, sel-sel ko mungkin juo Manarimo intervensi terapi untuak manunda atau mancagah degenerasi saraf. Talaik. Kami manyalasaikan kamungkinan iko malalui duo intervensi mandiri. Dalam metode partamo, kami marancang vektor virus takaik adeno (AAV) nan tagantuang pado Cre sahinggo MFN2 dapek diekspresikan sacaro selektif pado PN nan kakurangan OXPHOS dalam vivo (Gambar S7A). AAV nan manyandikan MFN2 jo gen reporter neon mCherry (Mfn2-AAV) diverifikasi pado kultur neuron primer sacaro in vitro, nan manyababkan MFN2 diekspresikan jo caro nan bagantuang pado Cre jo manyalamaikan morfologi mitokondria, sahinggo managah neuromutasi neuron pado Mfns, B Gambar SKO7). Salanjuiknyo, kami malakuan eksperimen in vivo untuak sacaro stereotaktis manyampaian Mfn2-AAV baumua 8 minggu ka korteks otak Mfn2cKO jo tikuih kontrol, jo manganalisis tikuih baumua 12 minggu (Gambar 4A). Tikuih Mfn2cKO nan dirawat mati (Gambar 1, A jo B) (16). Transduksi virus dalam vivo mahasilkan ekspresi selektif PN pado babarapo lingkaran otak ketek (Gambar S7, G jo H). Suntikan AAV kontrol nan hanyo mangaluaan mCherry (Ctrl-AAV) indak mampunyoi pangaruah nan signifikan pado tingkek degenerasi saraf pado hewan Mfn2cKO. Sabaliaknyo, analisis Mfn2cKO nan ditransduksi jo Mfn2-AAV manunjuakan efek palinduang nan signifikan dari lapisan sel PN (Gambar 4, B jo C). Sacaro khusus, kapadekan neuron tampaknyo ampia indak dapek dibedakan jo hewan kontrol (Gambar 4, B jo C, jo Gambar S7, H jo I). Ekspresi MFN1 tapi indak MFN2 samo-samo efektif dalam manyalamaikan kamatian neuron (Gambar 4C jo Gambar S7, C jo F), nan manunjuakan baso ekspresi MFN1 ektopik dapek sacaro efektif malangkapi kakurangan MFN2. Analisis labiah lanjuik pado tingkek PN tungga manunjuakan baso Mfn2-AAV sabagian gadang manyalamaikan ultrastruktur mitokondria, manormalkan tingkek mtDNA, jo mambaleh ekspresi tinggi panando anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C sampai E ). Inspeksi visual pado tikuih Mfn2cKO nan disalamekan dalam kaadaan istirahat manunjuakan baso postur tubuah jo gejala motoriknyo (garak S1 sampai S3) maningkek. Kasimpulannyo, eksperimen ko manunjuakan baso panundaan pamasuakan baliak MFN2 ka dalam PN nan sangaik kakurangan OXPHOS cukuik untuak mambaleh konsumsi mtDNA jo manginduksi aterosklerosis, sahinggo mancegah degenerasi akson jo kamatian neuron dalam vivo.
(A) Skema nan manunjuakan jadwal eksperimen untuak manyuntikkan AAV nan manyandikan MFN2 katiko jalur metabolisme nan ditunjukkan diaktifkan. (B) Foto konfokal perwakilan dari bagian otak ketek nan baumua 12 minggu nan ditransduksi jo tikuih Mfn2cKO pado 8 minggu dan diagiah label jo antibodi anti-Calbindin. Kanan: Skala serat akson. Skala zoom akson adolah 450 jo 75 μm. (C) Kiri: Pangukuran kapadekan sel Purkinje pado lingkaran transduksi AAV (AAV+) (analisis varians satu arah; n = 3 tikuih). Kanan: analisis fokus mtDNA pado PN nan ditransduksi pado minggu 12 (uji t indak basandiang; n = 6 sel dari tigo tikuih). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mikrograf elektron transmisi perwakilan dari PN bagian otak Mfn2cKO nan ditransduksi jo vektor virus nan ditunjukkan. Topeng warna pink manggambarkan daerah nan diduduaki dek dendrit, jo kotak batitik-titik kuniang manggambarkan zoom nan disadiokan di sabalah kanan; n mawakili intinyo. Batang skala, 1μm. (E) manunjuakan contoh pewarnaan PCx pado PN nan ditransduksi pado 12 minggu. Batang skala, 20μm. OE, ekspresi nan balabiah; FC, lipek ganti.
Akhianyo, kami manyalidiak pantiangnyo kalangsuangan hiduik sel nan diinduksi peroksidase pado PN nan alah mangalami disfungsi OXPHOS. Kami manghasilkan mCherry nan manyandikan AAV-shRNA (RNA jepit rambuik pendek) sacaro khusus manargetakan mRNA PCx tikuih (AAV-shPCx), jo manyuntikkan virus atau kontrolnyo nan diacak-acakan (AAV-scr) ka dalam otak tikuih Mfn2cKO. Suntikan dilakukan pado minggu kaampek umua (Gambar 5A) untuak mancapai knockdown PCx nan efektif salamo periode katiko ekspresi PCx maningkek (Gambar 3C) jo lapisan sel PN masih utuh (Gambar 1A). Paralu diparatian baso manumbangkan PCx (Gambar S8A) manyababkan percepatan kamatian PN nan signifikan, nan marupoan satu-satunyo cincin infeksi nan dibatasi (Gambar 5, B jo C). Untuak mamahami mekanisme efek metabolisme nan diinduksi dek pangaturan PCx, kami mampalajari status redoks PN sasudah PCx digusur jo biosensor optik nan dimediasi AAV Grx1-roGFP2 diekspresikan sacaro sarantak (Gambar S8, B sampai D) untuak manelaah glutation dari peptida 3 relatif). Kamudian, kami malakuan mikroskopi pencitraan saumua hiduik fluoresensi duo foton (FLIM) pado irisan utak akut dari Mfn2cKO nan baumua 7 minggu atau kawan sampah kontrol untuak mandeteksi parubahan potensial status redoks sitoplasma sasudah mamverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E sampai G). Analisis manunjuakan paningkekan nan signifikan dalam kaadaan oksidasi dari satu PN Mfn2cKO nan kurang ekspresi PCx, nan babeda jo neuron kontrol atau PN Mfn2cKO nan hanyo mengekspresikan shRNA nan diacak (Gambar 5, D jo E). Katiko ekspresi PCx diatur ka bawah, persentase PN Mfn2cKO nan manunjuakan kaadaan nan sangaik taoksidasi maningkek labiah dari tigo kali (Gambar 5E), nan manunjuakan baso pangaturan PCx naiak mampatahankan kapasitas redoks neuron nan degenerasi.
(A) Skema nan manunjuakan jadwal eksperimen untuak manyuntikkan AAV nan manyandikan shPCx katiko jalur metabolisme nan ditunjukkan diaktifkan. (B) Foto konfokal perwakilan dari bagian otak ketek nan baumua 8 minggu pado tikuih Mfn2cKO nan ditransduksi jo dilabeli jo antibodi anti-kalsineurin pado 4 minggu. Batang skala, 450 μm. (C) Kuantifikasi kapadekan sel Purkinje pado loop nan ditransduksi AAV (analisis varians satu arah; n = 3 sampai 4 tikuih). Data dinyatoan sabagai rato-rato±SEM; ***P<0,001. (D) Gambar FLIM nan mawakili manunjuakan rentang hiduik rato-rato PN baumua 7 minggu nan mangaluaan sensor redoks glutation Grx1-roGFP2 dalam kondisi eksperimen nan ditantuan. Rasio LUT (tabel pancarian): interval wakatu batahan iduik (dalam pikodetik). Batang skala, 25μm. (E) Histogram manunjuakan pambagian nilai maso hiduik Grx1-roGFP2 dari (D) (n=158 sampai 368 sel pado duo tikuih dalam satiok kondisi). Bagan pai di ateh satiok histogram: manunjuakan jumlah sel jo nilai maso hiduik nan signifikan labiah panjang (merah, taoksidasi) atau labiah pendek (biru, bakurang), nan malabihi 1 SD dari nilai maso hiduik rato-rato pado CTRL-AAV-scr. (F) Model nan diusulkan manunjuakan efek palinduang dari upregulasi PCx neuron.
Sacaro kasaluruahan, data nan kami sadiokan di siko manunjuakan baso ekspresi ulang MFN2 dapek sapanuahnyo manyalamaikan PN nan alah lanjut jo defisiensi OXPHOS nan barek, kahabisan mtDNA nan barek, jo morfologi sarupo ista nan sangaik abnormal, sahinggo manyadiokan kamajuan taruih manaruih bahkan pado panyakik nan alah lanjut. Neurodegenerasi mambarikan bukti nan dapek dibaliakkan dari tahap sabalun kamatian sel. Tingkat fleksibilitas metabolisme ko labiah lanjuik ditakankan dek kamampuan neuron untuak manginduksi aterosklerosis (pangambilan ulang siklus TCA), nan mangambati ekspresi PCx pado PN nan kurang OXPHOS jo maningkekan kamatian sel, sahinggo bamain peran palinduang (Gambar 5F).
Dalam panalitian ko, kami mambarikan bukti baso tanggapan PN taradok disfungsi OXPHOS adolah untuak sacaro baansua-ansua bakumpua ka aterosklerosis siklus TCA malalui jalur aktivasi diferensial nan diaktifkan dek program metabolisme. Kami mamastian analisis proteomik jo banyak metode saling malangkapi jo mangungkapkan baso katiko ditantang dek disfungsi mitokondria nan barek, neuron mampunyoi bantuak elastisitas metabolisme nan alun dikatahui sabalunnyo. Nan mambuek kami takajuik, saluruah proses pangabuangan ulang alun tantu manandoi kaadaan metabolisme terminal nan mangiriangi neurodegenerasi sacaro baansua-ansua jo indak dapek dibaliakkan, tapi data kami manunjuakan baso itu mungkin marupoan neuron pamaliharoan bahkan pado tahap sabalun kamatian sel Mekanisme kompensasi fungsional. Tamuan iko manunjuakan baso neuron mampunyoi tingkek plastisitas metabolisme nan cukuik gadang dalam tubuah. Fakta iko mambuktikan baso pangaruah baliak MFN2 kudian dapek mambaleh ekspresi panando metabolisme kunci jo mancagah degenerasi PN. Sabaliaknyo, inyo mangambati aterosklerosis jo mampacapek saraf. transeksual.
Salah satu temuan nan paliang manarik dalam panalitian kami adolah baso PN nan kurang OXPHOS dapek mamodifikasi metabolisme siklus TCA jo caro mangatur enzim nan sacaro khusus marangsang arteriosklerosis. Pangaturan ulang metabolisme adolah ciri umum sel kanker, babarapo di antaronyo mangandalkan glutamin untuak malangkapi parantara siklus TCA untuak manghasilkan setara pangurangan, nan mandorong rantai pernapasan jo mampatahankan produksi prekursor biosintesis lipid jo nukleotida (39 , 40). Sabuah panalitian nan baru-baru ko manunjuakan baso pado jaringan tepi nan mangalami disfungsi OXPHOS, rekoneksi metabolisme glutamin/glutamat juo marupoan ciri nan manonjol (5, 41), di mano arah masuaknyo glutamin ka dalam siklus TCA tagantuang pado Karano bareknyo luko OXPHOS (41). ). Namun, kurangnyo bukti nan jaleh tantang kasamoan apopun dari plastisitas metabolisme neuron dalam tubuah jo kamungkinan relevansinyo dalam konteks panyakik. Dalam panalitian in vitro nan baru-baru ko, saraf kortikal primer ditunjukkan untuak manggarakkan kolam glutamat untuak transmisi saraf, sahinggo mandorong metabolisme oksidatif jo aterosklerosis dalam kondisi stres metabolisme (42). Paralu diparatian baso di bawah panghambatan farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat dipicayoi mampatahankan sintesis oksaloasetat pado neuron granul otak ketek nan dibudidayakan (34). Namun, relevansi fisiologis dari mekanisme-mekanisme iko jo jaringan utak (di mano aterosklerosis dipicayoi tarutamo tabateh pado astrosit) masih mampunyoi signifikansi fisiologis nan pantiang (43). Dalam hal iko, data kami manunjuakan baso PN nan rusak dek OXPHOS dalam tubuah dapek baraliah ka degradasi BCAA jo karboksilasi piruvat, nan marupoan duo sumber utamo suplemen bahan perantara kolam TCA. Walaupun kontribusi nan diduga dari katabolisme BCAA pado metabolisme energi saraf alah diusulkan, salain peran glutamat jo GABA untuak transmisi saraf (44), masih alun ado bukti untuak mekanisme iko dalam vivo. Dek karano itu, mudah untuak baspekulasi baso PN nan indak bafungsi dapek sacaro otomatis maimbangi konsumsi bahan parantara TCA nan didorong dek proses asimilasi jo maningkekan aterosklerosis. Sacaro khusus, upregulasi PCx mungkin diparaluan untuak mampatahankan paningkekan pamintaan asam aspartat, nan alah ditunjukkan pado sel-sel nan bakambang biak jo disfungsi mitokondria (45). Namun, analisis metabolomik kami indak mangungkapkan parubahan signifikan pado tingkek kaadaan mantap asam aspartat pado PN Mfn2cKO (Gambar S6A), nan dikiro mancaminkan pamanfaatan metabolisme nan babeda dari asam aspartat antaro sel nan bakambang biak jo neuron pasca-mitosis . Walaupun mekanisme tapek dari upregulasi PCx pado neuron nan indak bafungsi dalam vivo masih paralu dicirikan, kami manunjuakan baso tanggapan dini ko mamainkan peran pantiang dalam mampatahankan kaadaan redoks neuron, nan ditunjukkan dalam eksperimen FLIM pado irisan otak ketek. Sacaro khusus, mancagah PN dari mangatur PCx ​​ka ateh dapek manyababkan kaadaan nan labiah taoksidasi jo mampacapek kamatian sel. Aktivasi degradasi BCAA jo karboksilasi piruvat bukanlah caro untuak mancirikan jaringan tepi disfungsi mitokondria (7). Dek karano itu, mareka tampaknyo manjadi ciri prioritas dari neuron nan kakurangan OXPHOS, walaupun bukan satu-satunyo ciri, nan pantiang untuak degenerasi saraf. .
Panyakik otak ketek adolah jinih panyakik saraf nan heterogen nan biasonyo tanyato sabagai ataksia jo acok marusak PN (46). Populasi neuron ko sangaik rawan jo disfungsi mitokondria karano degenerasi selektifnyo pado tikuih cukuik untuak mareproduksi banyak gejala motorik nan mancirikan ataksia spinoserebelum manusia (16, 47, 48). Manuruik laporan, model tikuih transgenik jo gen mutan dihubuangkan jo ataksia spinoserebelum manusia jo mampunyoi disfungsi mitokondria (49, 50), nan manakankan pantiangnyo mampalajari akibaik defisiensi OXPHOS pado PNPH. Dek karano itu, sangaik cocok untuak mangisolasi jo mampalajari populasi neuron nan unik ko sacaro efektif. Namun, mangingat baso PN sangaik sensitif jo takanan jo manyumbang proporsi nan randah dari saluruah populasi sel otak ketek, untuak banyak panalitian nan babasis omics, pamisahan selektif dari mareka sabagai saluruah sel masih manjadi aspek nan manantang. Walaupun ampia indak mungkin untuak mancapai kurangnyo kontaminasi mutlak dari jinih sel lain (tarutamo jaringan dewasa), kami manggabuangkan langkah disosiasi nan efektif jo FACS untuak mandapekkan jumlah neuron nan cukuik layak untuak analisis proteomik hilir, dan mampunyoi cakupan protein nan cukuik tinggi nan dibandiangkan jo (51) Dengan manjago kelangsungan hiduik saluruah sel, metode nan kami sadiokan di siko mamungkinkan kami indak hanyo untuak mamareso parubahan jalur metabolisme pado mitokondria, tapi juo untuak mamareso parubahan pado rekan-rekan sitoplasmanyo, nan malangkapi panggunoan pangayaan label membran mitokondria khusus untuak jinih sel mitokondria baru (52, 53) Metode nan kami gambarkan indak hanyo takaik jo kajian sel Purkinje, tapi dapek jo mudah diterapkan pado jinih sel apo sajo untuak mangatasi parubahan metabolisme pado utak nan bapanyakik, tamasuak model disfungsi mitokondria lainnyo.
Akhianyo, kami alah maidentifikasi jendela terapi salamo proses susunan ulang metabolisme ko nan dapek sacaro sapanuahnyo mambaleh tando-tando kunci stres seluler jo mancagah degenerasi saraf. Dek karano itu, mamahami implikasi fungsional dari kabel ulang nan dijalehan di siko dapek mambarikan wawasan mendasar tantang kamungkinan ubek untuak mampatahankan kalayakan hiduik neuron salamo disfungsi mitokondria. Panalitian di maso datang nan batujuan untuak mambedah parubahan metabolisme energi pado jinih sel utak lainnyo diparaluan untuak mangungkapkan sapanuahnyo kalayakan prinsip ko pado panyakik saraf lainnyo.
Tikuih MitoPark alah dijalehan sabalunnyo (31). Tikuih C57BL/6N jo gen Mfn2 nan maapik loxP alah dijalehan sabalunnyo (18) jo disilang jo tikuih L7-Cre (23). Katurunan heterozigot ganda nan dihasilkan kamudian disilangkan jo tikuih homozigot untuak mahasiakan knockout gen spesifik Purkinje untuak Mfn2 (L7-cre). Dalam himpunan bagian kawin, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (baranti-mtYFP) diperkenalkan malalui silang tambahan (20). Sagalo prosedur hewan dilakukan sasuai jo padoman Eropa, nasional jo limbago sarato disetujui dek LandesamtfürNatur dari Umwelt jo Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westfalia, Jerman. Karajo hewan juo maikuiki bimbingan Federasi Eropa untuak Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium.
Sasudah dibius dislokasi serviks padusi hamil, embrio tikuih diisolasi (E13). Korteks dibedah dalam Larutan Garam Saimbang Hanks (HBSS) nan ditambahi jo Hepes 10 mM dan dilewakan pado Medium Garuda Modifikasi Dulbecco nan manganduang papain (20 U/ml) jo sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan dalam DMEM) jo disosiasikannyo jo pencernaan enzimatik. Ml) pado suhu 37°C salamo 20 minik, dan kamudian digiliang sacaro mekanis dalam DMEM nan ditambahi jo serum sapi janin 10%. Sel-sel ditanam pado panutuik kaco nan dilapisi jo polilisin pado kapadekan 2×106 per hidangan kultur 6 cm atau pado kapadekan 0,5×105 sel/cm2 untuak analisis pencitraan. Sasudah 4 jam, media diganti jo media bebas serum Neurobasal nan manganduang suplemen B27 1% jo GlutaMax 0,5 mM. Neuron kamudian dipaliharo pado suhu 37°C jo 5% CO2 sapanjang pacobaan, jo diagiah makan sakali saminggu. Untuak manginduksi rekombinasi sacaro in vitro, 3 μl (hidangan kultur 24 sumur) atau 0,5 μl (piringan 24 sumur) dari vektor virus AAV9 barikuik digunoan untuak maubek neuron pado hari kaduo sacaro in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Gen Tambahan, nomor katalog 105530-AAV9) jo AAV9.
DNA pelengkap Mfn1 jo Mfn2 tikuih (nan didapek dari plasmid Addgene #23212 jo #23213, masiang-masiang) ditandoi jo urutan V5 (GKPIPNPLLGLDST) pado ujuang C, jo manyatukan jo mCherry dalam bingkai malalui urutan T2A. Grx1-roGFP2 adolah hadiah dari Heidelberg TP Dick DFKZ. Dengan mangganti kaset tdTomato manggunoan metode kloning konvensional, kaset iko disubkloning ka dalam tulang pungguang pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomor referensi Addgene 28306) untuak manghasilkan pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5, Vektor fleks-mceri-t2a-mfn1-v5 jo paav-cag-fleks-grx-rogfp2. Strategi nan sarupo digunoan untuak manghasilkan vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCeri. Untuak manghasilkan konstruksi AAV-shPCx, diparalukan vektor AAV plasmid (Pambangun Vektor, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA # 1]), nan manganduang urutan DNA nan manyandikan shRNA nan manargetakan PCx tikuih (5 3′) Di bawah kendali promotor U6, mCherry digunoan di bawah kendali promotor CMV. Pambuatan vektor AAV bantu dilakukan sasuai jo instruksi pambueknyo (Cell Biolabs). Singkeknyo, gunoan plasmid pamindahan nan mambaok mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) sacaro samantaro Transfeksi sel mheav-29. atau gen pangkode Grx-roGFP2, sarato mangkode protein kapsid AAV1 jo protein aksesori Plasmid plasmid pamasangan, manggunoan metode kalsium fosfat. Supernatan virus kasa didapek jo siklus beku-cair dalam mandi es/etanol kariang jo sel-sel nan dilisis dalam garam penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV dimurnikan jo ultrasentrifugasi gradien yodiksanol nan indak taruih manaruih (24 jam pado 32.000 rpm jo 4°C) dan dikonsentrasikan jo manggunoan saringan sentrifugal ultra-15 Amicon. Titer genom dari 2,9 × 1013 salinan genom (GC)/ml, 6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCeri (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX diukua sacaro nyato (waktu nyato PCR), diukua sacaro kuantitas sabalunnyo. (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 x 1013 GC/ml) jo AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Neuron primer dikikis dalam PBS 1x dingin es, dipelet, dan kamudian dihomogenkan dalam penyangga lisis natrium deoksikolat/PBS 0,5% nan manganduang fosfatase jo panghambat protease (Roche). Kuantifikasi protein dilakukan jo manggunoan uji asam bisinkoninat (Ilmiah Termo Fisher). Protein-protein tu kamudian dipisahkan jo elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, dan kamudian diblot ka membran poliviniliden fluorida (GE Healthcare). Blokir tampek nan indak spesifik jo inkubasi jo antibodi primer (caliak Tabel S1 untuak labiah jalehnyo) dalam susu 5% dalam TBST (garam nan disangga Tris jo Tween), langkah-langkah pambasuah jo antibodi sekunder dalam Inkubasi TBST. Inkubasi jo antibodi primer samalam pado suhu +4°C. Sasudah dicuci, oleskan antibodi sekunder salamo 2 jam pado suhu ruangan. Salanjuiknyo, jo manginkubasi blot nan samo jo antibodi anti-β-aktin, pamuatan nan samo dikonfirmasi. Deteksi jo caro maubah manjadi kimia luminesen jo maningkekan kimia luminesen (GE Healthcare).
Neuron nan sabalunnyo dibijikan pado panutuik kaco diperbaiki jo 4% paraformaldehida (PFA)/PBS pado titiak wakatu nan ditantuan pado suhu ruangan salamo 10 minik. Panutuik partamo kali diresapi jo 0,1% Triton X-100/PBS salamo 5 minik pado suhu ruangan, dan kamudian dalam penyangga pamblokiran [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Pado hari kaduo, panutuik dibasuah jo penyangga pamblokiran dan diinkubasi jo antibodi sekunder konjugasi fluorofor nan sasuai salamo 2 jam pado suhu ruangan; akhianyo, sampel dibasuah sacaro tuntas dalam PBS jo 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) nan diwarnai dan kamudian dipasang pado slide mikroskop jo Aqua-Poly/Mount.
Tikuih (jantan jo batino) dibius jo suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) jo xilazin (10 mg/kg) dan diagiah sacaro subkutan jo ubek panghilang raso sakik karprofen (5 mg/kg) , Dan dilatakan dalam alat stereotaktik (Kopd a) jo paralatan angek. Paparkan tangkurak jo gunoan bor gigi untuak manipiskan bagian korteks otak ketek nan sasuai jo tulang mis (dari lambda: ikua 1,8, lateral 1, sasuai jo lobus IV jo V). Gunoan jarum jarum suntik nan malengkung untuak hati-hati mambuek lubang ketek di tangkurak untuak maindari mangganggu pambuluah darah di bawah. Kudian kapiler kaco nan ditarik tipih dimasuakkan sacaro lambek ka dalam lubang mikro (dari -1,3 sampai -1 di sisi ventral dura mater), dan 200 sampai 300 nl AAV disuntikkan ka dalam mikro-injektor (Narishige) jo jarum suntik manual (Narishige tisure) pado periode takanan several2. jendela 10 minik. Sasudah infus, latakkan kapiler salamo 10 minik lai untuak mamungkinkan virus manyebar sapanuahnyo. Sasudah kapiler ditarik, kulik dijaik elok-elok untuak maminimalikan paradangan luko jo mamungkinkan hewan untuak cegak. Binatang-binatang tu dirawat jo ubek panghilang raso sakik (caspofen) salamo babarapo hari sasudah operasi, salamo wakatu itu kondisi fisiknyo dipantau sacaro hati-hati dan kamudian inyo dieutanasia pado titiak wakatu nan dinyatoan. Sagalo prosedur dilakukan sasuai jo padoman Eropa, nasional jo limbago sarato disetujui dek LandesamtfürNatur dari Umwelt jo Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westfalia, Jerman.
Binatang dibius jo ketamin (100 mg/kg) jo xilazin (10 mg/kg), dan jantuang diperfusi jo PBS 0,1 M talabiah dahulu, dan kamudian jo PFA 4% dalam PBS. Jaringan dibedah jo diperbaiki dalam PFA/PBS 4% samalam pado suhu 4°C. Sabuah pisau bagetar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) digunoan untuak manyiapkan bagian sagital (taba 50 μm) dari utak tatap dalam PBS. Kacuali dinyatoan lain, pewarnaan bagian-bagian nan mangambang bebas dilakukan sarupo nan dijalehan di ateh (13) pado suhu ruangan jo pangadukan. Singkeknyo, partamo, irisan nan didapek diresapkan jo Triton X-100/PBS 0,5% salamo 15 minik pado suhu ruangan; untuak babarapo epitope (Pcx jo Shmt2), jo caro dalam penyangga tris-EDTA pado suhu 80°C (PH 9) angekkan irisan salamo 25 minik alih-alih langkah iko. Salanjuiknyo, bagian-bagian tu diinkubasi jo antibodi primer (caliak Tabel S1) dalam penyangga pamblokiran (3% BSA/PBS) pado suhu 4°C samalam jo pangadukan. Bisuaknyo, bagian-bagian tu dibasuah jo penyangga pamblokiran dan diinkubasi jo antibodi sekunder konjugasi fluorofor nan sasuai salamo 2 jam pado suhu ruangan; akhianyo, bagian-bagian tu dibasuah sacaro langkok dalam PBS, diwarnai balawanan jo DAPI, dan kamudian diparatian jo AquaPolymount Pado slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pamindaian laser (TCS SP8-X atau TCS Digital Light Sheet, Mikrosistem Leica) nan dilangkoki jo laser cahayo putiah jo laser ultraviolet 405 dioda digunoan untuak mancitrakan sampel. Dengan mangganja fluorofor jo mangumpuakan sinyal jo Detektor Hibrida (HyDs), parangkat lunak LAS-X digunoan untuak mangumpuakan gambar nan basusun sasuai jo pancampuran sampel Nyquist dalam mode urutan: untuak panel non-kuantitatif, itu adolah sinyal nan sangaik dinamis (misalnyo, pado sel somatik jo dendrit) mt Mode TarangR). Gating 0,3 sampai 6 ns dilakekkan untuak mangurangi latar balakang.
Pencitraan wakatu nyato dari sel-sel nan diuruik. Sasudah diuruik dalam media Neurobasal-A nan manganduang suplemen B27 1% jo GlutaMax 0,5 mM, sel-sel langsuang dibijikan pado geseran kaco nan dilapisi poli-l-lisin (μ-Geser8 Sumur, Ibidi, nomor katalog 80826) , Dan kamudian disimpan pado suhu 1% dan CO2. untuak manatap. Pencitraan wakatu nyato dilakukan pado mikroskop konfokal pamindaian laser Leica SP8 nan dilangkoki jo lensa objektif minyak laser putiah, HyD, 63×[1,4 bukaan angka (NA)] jo panggung pamanasan.
Tikuih dibius jo capek jo karbon dioksida dan dipotong kapalonyo, utaknyo dikaluakan sacaro capek dari tangkurak, dan dipotong manjadi bagian sagital taba 200μm (untuak percobaan pelabelan Fi3C) atau taba 275μm (untuak duo percobaan foton) nan diisi jo bahan-bahan crece barikuik TheVH-50. Scientific, Walldorf, Jerman) diisi jo zat-zat barikuik: 125 mM dingin es, jenuh karbon (95% O2 jo 5% CO2) Ca2 randah + cairan otak tulang balakang buatan (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium m3, pho2. glukosa, Cacl2 0,5 mM jo Cl2 3,5 mM (takanan osmotik 310 inggo 330 mmol). Pindahan irisan utak nan didapek ka ruang pra-inkubasi nan manganduang Ca2 + ACSF nan labiah tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM Ca2,10 mM. MgCl2) Sadang) pH 7,4 jo 310 sampai 320 mmol).
Salamo proses pencitraan, irisan-irisan dipindahan ka ruangan pencitraan khusus, jo pacobaan dilakukan di bawah perfusi ACSF taruih manaruih pado suhu konstan 32° inggo 33°C. Mikroskop pamindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) nan dilangkoki jo lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, aia), laser Ti: Safir (Bunglon Visi II, Koheren) digunoan untuak pencitraan irisan. Modul FLIM (PikoHarp300, PikoKuan).
FLIM dari Grx1-roGFP2. Parubahan kaadaan redoks sitoplasma PN diukua jo FLIM duo foton pado irisan utak sagital, di mano biosensor Grx1-roGFP2 manargetakan PN. Pado lapisan PN, bidang akuisisi dipiliah sakitar 50 inggo 80 μm di bawah pamukoan irisan untuak mamastian baso ado PN nan layak (yaitu, kurangnyo struktur manik-manik atau parubahan morfologis neuron di sapanjang dendrit) jo sensor roGFP2 positif ganda jo PCx nan manyandikan shRNA mSakura). Kumpuakan gambar tumpukan tunggal jo zoom digital 2x [panjang galombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: HyD internal, kalompok saringan fluoresein isotiosianat (FITC)] jo rato-rato gambar dalam wakatu 2 inggo 3 minik digunoan untuak mamastian baso cukuik foton dikumpuakan (1000 foton sacaro kasaluruahan) untuak pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 jo verifikasi kondisi FLIM dilakukan jo mamantau nilai maso iduik roGFP2 katiko manambahkan H2O2 eksogen 10 mM ka ACSF perfusi (untuak mamaksimalkan oksidasi, nan maakibaikan paningkekan maso iduik). pangurangan, nan maakibaikkan panurunan maso hiduik) (Gambar S8, D sampai G). Gunokan perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 untuak manganalisis hasil nan didapek, cocokkan kurva peluruhan eksponensial tunggal dari saluruah gambar ka IRF nan diukua (fungsi tanggapan instrumen), dan χ2 adolah kiro-kiro 1. Untuak mahituang maso hiduik topeng tunggal dan maso hiduik sacaro manual di sakitar maso hiduik saraf. digunoan untuak kuantifikasi.
Analisis potensi mitokondria nan ado. Sasudah bagian akut diinkubasi jo TMRM 100 nM nan langsuang ditambahkan ka ACSF nan diperfusi salamo 30 minik, parubahan potensial mitokondria PN diukua jo mikroskop duo foton. Pencitraan TMRM dilakukan jo caro mangganja probe pado 920 nm jo manggunoan HyD internal (tetrametilrodamin isotiosianat: 585/40 nm) untuak mangumpuakan sinyal; jo manggunoan panjang galombang eksitasi nan samo tapi manggunoan HyD internal nan babeda (FITC :525/50) untuak mancitrakan mtYFP. Gunoan plug-in Kalkulator Gambar ImageJ untuak manelaah potensi mitokondria pado tingkek sel tungga. Singkeknyo, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) digunoan untuak maidentifikasi daerah mitokondria nan manunjuakan sinyal TMRM di Somali Purkinje pado gambar konfokal tumpukan tungga dari saluran nan sasuai. Kudian luas piksel pado topeng nan dihasilkan diukua, dan kamudian dinormalisasi pado gambar tumpukan tunggal ambang batas nan sasuai dari saluran mtYFP untuak mandapekkan fraksi mitokondria nan manunjuakan potensi mitokondria.
Gambar iko dibuang jo parangkat lunak Huygens Pro (Pencitraan Volume Ilmiah). Untuak gambar ubin nan dipindai, montase ubin tungga dibuek manggunoan algoritma jahitan otomatis nan disadiokan dek parangkat lunak LAS-X. Sasudah kalibrasi gambar, gunoan ImageJ jo Adobe Photoshop untuak mamproses gambar labiah lanjuik jo manyasuaian cahayo jo kontrasnyo sacaro saragam. Gunoan Adobe Ilustrator untuak manyiapkan grafis.
analisis fokus mtDNA nan ado. Jumlah lesi mtDNA diukua pado bagian otak ketek nan diagiah label jo antibodi taradok DNA jo mikroskop konfokal. Satiok daerah sasaran dibuek untuak tubuah sel jo inti satiok sel, dan daerah masiang-masiang dihituang manggunoan plug-in Multi Measure (parangkat lunak ImageJ). Kurangi luas inti dari luas tubuah sel untuak mandapekkan luas sitoplasma. Akhianyo, plug-in Analisa Partikel (parangkat lunak ImageJ) digunoan untuak sacaro otomatis mangukua titiak DNA sitoplasma nan manunjuakan mtDNA pado gambar ambang batas, jo hasil nan didapek dinormalisasi ka rato-rato PN tikuih CTRL. Hasianyo dinyatoan sabagai jumlah rato-rato nukleosida per sel.
Analisis ekspresi protein nan ado. Gunoan plug-in Kalkulator Gambar ImageJ untuak manelaah ekspresi protein pado PN pado tingkek sel tungga. Singkeknyo, pado gambar konfokal tungga dari saluran nan sasuai, malalui parsamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), daerah mitokondria nan manunjuakan imunoreaktivitas taradok antibodi tatantu di Purkina diidentifikasi. Kudian luas piksel pado topeng nan dihasilkan diukua, dan kamudian dinormalisasi pado gambar tumpukan tunggal ambang batas nan sasuai dari saluran mtYFP untuak mandapekkan fraksi mitokondria dari protein nan ditampilkan.
Analisis kapadekan sel Purkinje. Plug-in Pahitung Sel dari ImageJ digunoan untuak manelaah kapadekan Purkinje jo mambagi jumlah sel Purkinje nan dihituang jo panjang cincin otak nan diduduaki dek sel-sel nan dihituang.
Persiapan jo pangumpuaan sampel. Utak dari kalompok kontrol jo tikuih Mfn2cKO diparatian dalam 2% PFA/2,5% glutaraldehida dalam penyangga fosfat (PB) 0,1 M, dan kamudian bagian koronal disiapkan jo manggunoan silia (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Katebalan penyangga μm1 o% oPBn) tetraoksida jo 1,5% kalium ferosianida pado suhu ruangan salamo 1 jam. Bagian-bagian tu dibasuah tigo kali jo aia suling, dan kamudian diwarnai jo etanol 70% nan manganduang 1% uranil asetat salamo 20 minik. Bagian-bagian tu kamudian didehidrasi dalam alkohol nan batingkat dan disematkan dalam damar epoksi Durcupan ACM (damar pengecoran Araldit M) (Ilmu Mikroskopi Elektron, nomor katalog 14040) antaro geser kaco nan balapis silikon, dan akhianyo pado suhu 60°C Dipolimerisasi dalam tungku48 jam. Daerah korteks otak ketek dipiliah jo bagian ultratipih 50 nm dipotong pado Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) jo dipiliah pado kisi celah timbago 2×1 mm nan dilapisi jo film polistirena. Bagian-bagian tu diwarnai jo larutan uranil asetat 4% dalam H2O salamo 10 minik, dibasuah jo H2O babarapo kali, kamudian jo sitrat timah Reynolds dalam H2O salamo 10 minik, dan kamudian dibasuah jo H2O babarapo kali. Mikrograf diambiak jo mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Serikat) manggunoan kamera digital TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Amerika Serikat). Jerman).
Untuak tikuih nan tainfeksi AAV, utak dipisahkan jo diirih manjadi bagian sagital taba 1 mm, jo ​​otak ketek diperiksa manggunoan mikroskop fluoresensi untuak maidentifikasi cincin nan tainfeksi AAV (yaitu, mCherry nan mengekspresikan). Hanyo eksperimen di mano suntikan AAV mahasilkan efisiensi transduksi nan sangaik tinggi dari lapisan sel Purkinje (yaitu ampia saluruah lapisan) pado sakurang-kurangnyo duo cincin otak ketek nan baturuik-turuik nan digunoan. Loop nan ditransduksi AAV dibedah mikro untuak pasca-fiksasi samalam (4% PFA jo 2,5% glutaraldehida dalam penyangga kakao 0,1 M) dan diolah labiah lanjuik. Untuak panyematan EPON, jaringan tatap dibasuah jo penyangga koko natrium 0,1 M (Applichem), dan diinkubasi jo 2% OsO4 (os, Layanan Sains; Caco) dalam penyangga koko natrium 0,1 M (Applichem) 4 Jam, kamudian dibasuah salamo 2 jam. Ulang 3 kali jo penyangga kokamida 0,1 M. Salanjuiknyo, rangkaian etanol nan naiak digunoan untuak manginkubasi satiok larutan etanol pado suhu 4°C salamo 15 minik untuak mandehidrasi jaringan. Jaringan iko dipindahan ka propilen oksida jo diinkubasi samalam dalam EPON (Sigma-Aldrich) pado suhu 4°C. Latakkan tisu dalam EPON segar pado suhu ruangan salamo 2 jam, dan kamudian sematkan pado suhu 62°C salamo 72 jam. Gunoan ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) jo pisau intan (Diatome, Biel, Swiss) untuak mamotong bagian ultratipih 70 nm, jo ​​noda jo uranil asetat 1,5% salamo 15 minik pado suhu 37°C, sarato noda jo larutan timah sitrat 4 minik. Mikrograf elektron diambiak manggunoan mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) nan dilangkoki jo Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) jo perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Untuak dianalisa, mikrograf elektron diperoleh jo zoom digital 5000× atau 10.000×.
Analisis morfologi dari mitokondria nan ado. Untuak sadoalah analisis, kontur mitokondria masiang-masiang digariskan sacaro manual dalam gambar digital manggunoan parangkat lunak ImageJ. Parameter morfologi nan babeda-beda dianalisa. Kapadekan mitokondria dinyatoan sabagai persentase nan didapek jo mambagi total luas mitokondria satiok sel jo luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas inti sel) × 100. Kabulatan mitokondria dihituang jo rumus [4π∙2(luas)]./keliling. Morfologi ista mitokondria dianalisa jo dibagi manjadi duo kategori (“tabung” jo “lepuh”) sasuai jo bantuak utamonyo.
Analisis jumlah autofagosom/lisosom jo kapadekan. Gunoan parangkat lunak ImageJ untuak manggarisbawahi sacaro manual kontur satiok autofagosom/lisosom dalam gambar digital. Luas autofagosom/lisosom dinyatoan sabagai persentase nan dihituang jo mambagi total luas struktur autofagosom/lisosom satiok sel jo luas sitoplasma (luas sitoplasma=luas sel-luas inti)×100. Kapadekan autofagosom/lisosom dihituang jo mambagi jumlah total jo jumlah struktur autofagosom/lisosom per sel (dalam hal luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel-luas inti).
Pelabelan untuak pambagian akut jo panyiapan sampel. Untuak pacobaan nan mamaralukan panandoan glukosa, pindahan irisan utak akut ka ruang pra-inkubasi, nan manganduang karbon jenuh (95% O2 jo 5% CO2), Ca2 + ACSF tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, natrium penyangga m3O, Na3O 1,25 mM, Natrium fosfat 1,25 mM. 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 jo 2,0 mM MgCl 2, disasuaikan jo pH 7,4 jo 310 sampai 320 mOsm), di mano glukosa adolah 13 C 6- Panggantian glukosa (Eurisotop, nomor katalog CLM931). Untuak pacobaan nan mamaralukan pelabelan piruvat, pindahan irisan utak akut ka Ca2 + ACSF nan labiah tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, Ad2M d-glukosa 25,0 mM, Ca02M d-glukosa 25,0 mM). MgCl2, sasuaikan jo pH 7,4 jo 310 sampai 320mOsm), dan tambahkan 1-[1-13C]piruvat 1mM (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi bagian-bagian tu salamo 90 minik pado suhu 37°C. Pado akhia pacobaan, bagian-bagian tu dibasuah sacaro capek jo larutan baaia (pH 7,4) nan manganduang amonium karbonat 75 mM, dan kamudian dihomogenkan dalam 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: aia. Sasudah bagian-bagian diinkubasi di ateh es salamo 30 minik, sampel disentrifugasi pado 21.000 g salamo 10 minik pado suhu 4°C, jo supernatan nan janiah dikariangan dalam konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit kariang nan dihasilkan disimpan pado suhu -80°C sampai dianalisa.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa dari 13 asam amino nan diagiah label C. Untuak analisis kromatografi cair-spektrometri massa (JC-MS), pelet metabolit disuspensi ulang dalam 75μl aia kelas LC-MS (Sumur Madu). Sasudah sentrifugasi pado 21.000 g salamo 5 minik pado suhu 4°C, 20 μl dari supernatan nan diklarifikasi digunoan untuak analisis fluks asam amino, sadangkan siso ekstrak langsuang digunoan untuak analisis anion (caliak di bawah). Analisis asam amino dilakukan jo manggunoan protokol turunan benzoil klorida nan dijalehan sabalunnyo (55, 56). Pado langkah partamo, 10μl natrium karbonat 100 mM (Sigma-Aldrich) ditambahkan ka 20μl ekstrak metabolit, dan kamudian 10μl benzoil klorida 2% (Sigma-Aldrich) ditambahkan ka ACN kelas LC. Sampel diputar sabanta dan kamudian disentrifugasi pado suhu 21.000 g salamo 5 minik pado suhu 20°C. Pindahan supernatan nan dibersihkan ka dalam botol otosampel 2 ml jo sisipan kaco kerucut (volume 200 μl). Sampel dianalisa jo manggunoan sistem LC (Aia) kinerja ultra-tinggi Acquity iClass nan dihubuangkan jo spektrometer massa presisi resolusi tinggi (Ilmiah Termo Fisher). Untuak dianalisa, 2μl dari sampel turunan disuntikkan ka dalam kolom silika T3 kakuatan tinggi 100×1,0 mm (Aia) nan manganduang partikel 1,8μm. Laju alirannyo 100μl/min, jo sistem penyangga tadiri dari penyangga A (10 mM amonium format jo 0,15% asam formik dalam aia) jo penyangga B (ACN). Gradiennyo sarupo barikuik: 0%B pado 0 minik; 0%B. 0 sampai 15% B pado 0 sampai 0,1 minik; 15 sampai 17% B pado 0,1 sampai 0,5 minik; B pado 17 sampai 55% pado 0,5 sampai 14 minik; B pado 55 sampai 70% pado 14 sampai 14,5 minik; pado 14,5 sampai 70 sampai 100% B pado 18 minik; 100% B pado 18 sampai 19 minik; 100 sampai 0% B pado 19 sampai 19,1 minik; 0% B pado 19,1 sampai 28 minik (55, 56). Spektrometer massa QE-HF baoperasi dalam mode ionisasi positif jo rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 sampai 750. Resolusi nan diterapkan adolah 60.000, dan target ion kontrol keuntungan (AGC) nan didapek adolah 3×106, dan wakatu ion maksimum102. Sumber ionisasi elektrosemprotan nan dipanehan (ESI) baoperasi pado tegangan semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udaro sarung 60 AU (satuan suko-suko), jo aliran udaro tambahan 20 AU. 250°S. Lensa S diatur ka 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS dari asam organik nan diagiah label 13C. Endapan metabolit nan tasiso (55μl) dianalisa jo manggunoan sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Ilmiah Termo) nan dihubuangkan jo spektrometer massa QE-HF (Ilmiah Termo Fisher). Singkeknyo, 5μl ekstrak metabolit disuntikkan ka dalam kolom Dionex IonPac AS11-HC nan dilangkoki jo HPLC (2 mm×250 mm, ukuran partikel 4μm, Ilmiah Thermo Fisher) dalam mode loop parsial dorong-masuak jo rasio pangisian 1. )on. Kolom panjago dionex ionpac ag11-hc (2 mm x 50 mm, 4 m, ilmiah nelayan termo). Suhu kolom dipaliharo pado 30°C, jo otosampel diatur pado 6°C. Gunoan kartrid kalium hidroksida nan disadiokan jo aia deionisasi untuak manghasilkan gradien kalium hidroksida malalui pambangkik eluen. Pamisahan metabolit pado laju aliran 380μl/min, malakekkan gradien barikuik: 0 sampai 3 minik, KOH 10 mM; 3 sampai 12 minik, KOH 10 sampai 50 mM; 12 sampai 19 minik, KOH 50 sampai 100 mM; 19 sampai 21 minik , KOH 100 mM; 21 sampai 21,5 minik, KOH 100 sampai 10 mM. Kolom diimbangi baliak di bawah KOH 10 mM salamo 8,5 minik.
Metabolit nan dielusi digabuangan jo aliran suplemen isopropanol 150μl/min sasudah kolom dan kamudian diarahkan ka spektrometer massa resolusi tinggi nan baoperasi dalam mode ionisasi negatif. MS sadang mamantau kisaran massa dari m/z 50 sampai 750 jo resolusi 60.000. AGC diatur pado 1×106, jo wakatu ion maksimum dijago pado 100 ms. Sumber ESI nan dipanehan dioperasikan jo tegangan semprotan 3,5 kV. Pangaturan lain dari sumber ion adolah sarupo barikuik: suhu kapiler 275°C; aliran gas sarung, 60 AU; aliran gas bantu, 20 AU pado suhu 300°C, jo pangaturan lensa S manjadi 60 AU.
Analisis data dari metabolit nan diagiah label 13C. Gunoan perangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Ilmiah Termo Fisher) untuak analisis data rasio isotop. Identitas satiok senyawa diverifikasi dek senyawa acuan nan dapek diandalkan jo dianalisa sacaro mandiri. Untuak malakuan analisis pangayaan isotop, luas kromatogram ion nan diekstraksi (XIC) dari satiok isotop 13C (Mn) diekstraksi dari [M + H] +, di mano n adolah jumlah karbon senyawa sasaran, digunoan untuak manganalisis asam amino atau [ MH] + digunoan untuak manganalisis anion. Akurasi massa XIC kurang dari limo bagian per juta, jo akurasi RT adolah 0,05 minik. Analisis pangayaan dilakukan jo mahituang rasio satiok isotop nan tadeteksi jo jumlah sadoalah isotop senyawa nan sasuai. Rasio-rasio iko diagiah sabagai nilai persentase untuak satiok isotop, dan hasilnyo dinyatoan sabagai pangayaan persen molar (MPE), sarupo nan dijalehan sabalunnyo (42).
Pelet neuron nan alah dibekukan dihomogenkan dalam metanol 80% (v/v) nan dingin sarupo es, diputar-putar, jo diinkubasi pado suhu -20°C salamo 30 minik. Vortex sampel baliak dan aduk pado suhu +4°C salamo 30 minik. Sampel disentrifugasi pado suhu 21.000 g salamo 5 minik pado suhu 4°C, dan kamudian supernatan nan dihasilkan dikumpuakan jo dikariangan manggunoan konsentrator SpeedVac pado suhu 25°C untuak dianalisa salanjuiknyo. Sarupo nan dijalehan di ateh, analisis LC-MS dilakukan pado asam amino sel-sel nan diuruik. Manggunoan TraceFinder (versi 4.2, Ilmiah Termo Fisher), analisis data dilakukan jo manggunoan massa monoisotop dari satiok senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit dilakukan jo manggunoan paket perangkat lunak praprosesInti (57).
Persiapan irisan. Tikuih dibius sacaro capek jo karbon dioksida dan dipotong kapalonyo, utaknyo dikaluakan sacaro capek dari tangkurak, dan pisau getar nan diisi es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) digunoan untuak mamotongnyo manjadi 300 sampai 375% carbon gas O5d. CO2) Ca2 + ACSF randah (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM, CaCl2 1,0 mM jo pH Adju sampai MgCl302 6,0 mM. mOsm). Pindahan irisan utak nan didapek ka ruangan nan manganduang Ca2 + ACSF nan labiah tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM d-glukosa22l mM 4,0 mM. jo 310 sampai 320 mOsm). Simpan irisan-irisan tu salamo 20 inggo 30 minik supayo dapek dipulihkan sabalun direkam.
rekaman. Panggung mikroskop nan dilangkoki jo ruang rekaman tatap jo lensa objektif panyelaman aia 20x (Scientifica) digunoan untuak sadoalah rekaman. Sel-sel Purkinje nan diduga diidentifikasi jo (i) ukuran tubuah, (ii) lokasi anatomi otak ketek, jo (iii) ekspresi gen palaporan mtYFP nan bapanon. Pipet tambalan jo tahanan ujuang 5 sampai 11 megohm ditariak kalua dek kapiler kaco borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) jo pipet horizontal Instruments (P-1000), No. Sagalo rekaman dilakukan dek panguek penjepit tambalan npi ELC-03XS (npi elektronik GmbH, Tam, Jerman), nan dikontrol dek perangkat lunak Sinyal (versi 6.0, Elektronik Cambridge, Cambridge, Inggirih). Percobaan ko dicatat jo laju sampel 12,5 kHz. Sinyal ko disaring jo duo saringan Bessel pas pendek jo frekuensi pamotongan masiang-masiang 1,3 jo 10 kHz. Kapasitas membran jo pipet dikompensasi dek rangkaian kompensasi manggunoan panguek. Sagalo pacobaan dilakukan di bawah kontrol kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), nan dikontrol dek perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi jo analisis rutin saluruah sel. Langsuang sabalun mancatat, isi pipet jo larutan internal nan manganduang zat-zat barikuik: KCl 4,0 mM, NaCl 2,0 mM, EGTA 0,2 mM, kalium glukonat 135,0 mM, Hepes 10,0 mM, trifano. (Na) jo kreatinin fosfat 10,0 mM disasuaian jo pH 7,25, jo takanan osmotik 290 mOsm (sukrosa). Langsuang sasudah malakekkan gaya 0 pA untuak mamacahkan membran, potensi membran istirahat diukua. Tahanan masuak diukua jo malakekkan arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, jo -10 pA. Ukua gadangnyo tanggapan tegangan jo gunoan hukum Ohm untuak mahetong resistansi masuak. Aktivitas spontan dicatat dalam penjepit tegangan salamo 5 minik, jo sPSC diidentifikasi jo diukua di Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Danau Oswego, Oregon, Amerika Serikat) manggunoan skrip pangakuan satangah otomatis. Kurva IV jo arus keadaan mantap diukua jo caro manjepit baterai pado potensi nan babeda (mulai dari -110 mV) jo maningkekan tegangan dalam langkah 5 mV. Produksi AP diuji jo caro malakekkan arus depolarisasi. Jepit sel pado -70 mV sambia malakekkan pulsa arus depolarisasi. Sasuaikan ukuran langkah satiok unit rekaman sacaro tapisah (10 sampai 60 pA). Hituang frekuensi AP maksimum jo caro manual maetong lonjakan pulsa nan manyababkan frekuensi AP tatinggi. Ambang AP dianalisa jo manggunoan turunan kaduo dari pulsa depolarisasi nan partamo kali mamicu ciek atau labiah AP.
Konfigurasi jo analisis tambalan nan balubang. Lakukan rekaman tambalan nan balubang-lubang manggunoan protokol standar. Gunoan pipet bebas ATP jo GTP nan indak manganduang bahan-bahan barikuik: glukonat K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM jo MgCl2 2 mM, dan sasuaian jo pH 7,2 (manggunoan KOH). ATP jo GTP dihilangkan dari larutan intraseluler untuak mancagah permeabilitas membran sel nan indak takontrol. Pipet tambalan diisi jo larutan internal nan manganduang amfoterisin (kiro-kiro 200 inggo 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) untuak mandapekkan catatan tambalan nan balubang. Amfoterisin dilaruikkan dalam dimetil sulfoksida (konsentrasi akhia: 0,1 inggo 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO nan digunoan indak mampunyoi pangaruah nan signifikan pado neuron nan dipalajari. Salamo proses paninjuan, tahanan saluran (Ra) dipantau taruih manaruih, jo pacobaan dimulai sasudah amplitudo Ra jo AP stabil (20-40 minik). Aktivitas spontan diukua dalam penjepit tegangan jo/atau arus salamo 2 inggo 5 minik. Analisis data dilakukan jo manggunoan Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, Amerika Serikat), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Amerika Serikat) jo GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc. Amerika Serikat). Untuak maidentifikasi AP spontan, plug-in NeuroMatic v3.0c dari IgorPro digunoan. Otomatis maidentifikasi AP manggunoan ambang batas nan diagiah, nan disasuaian sacaro surang-surang untuak satiok catatan. Manggunoan interval lonjakan, tentukan frekuensi lonjakan jo frekuensi lonjakan instan maksimum jo frekuensi lonjakan rato-rato.
Isolasi PN. Dengan manyasuaian diri jo protokol nan dipublikasikan sabalunnyo, PN dimurnikan dari otak tikuih pado tahap nan ditantuan (58). Singkeknyo, otak ketek dibedah jo dicincang dalam media disosiasi nan dingin sarupo es [tanpa HBSS Ca2+ jo Mg2+, ditambahi jo glukosa 20 mM, penisilin (50 U/ml) jo streptomisin (0,05 mg/ml)], dan kamudian dicerna · media dalam mgSS1-papal1. / ml), papain (16 U / ml) jo deoksiribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Ubek salamo 30 minik pado suhu 30°C. Partamo cuci jaringan dalam media HBSS nan manganduang lendir talua (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) jo DNase (0,1 mg/ml) pado suhu ruangan untuak managah pencernaan enzimatik, dan kamudian pado media HBSS nan manganduang glukosa 20 mM), Giliang lembut dalam HBmylm5. (0,05 mg/ml) jo DNase (0,1 mg/ml) malapehan sel tungga. Suspensi sel nan dihasilkan disaring malalui saringan sel 70μm, kamudian sel-sel dipelet jo caro sentrifugasi (1110 rpm, 5 minik, 4°C) dan disuspensi baliak dalam media panyortiran [HBSS, ditambahi jo glukosa 20 mM, 20% stremilin sapi janin) Serum, (0,05 mg/ml)]; manelaah daya tahan sel jo propidium yodida jo manyasuaian kapadekan sel manjadi 1×106 inggo 2×106 sel/ml. Sabalun sitometri aliran, suspensi disaring malalui saringan sel 50 μm.
Sitometer aliran. Panyortiran sel dilakukan pado suhu 4°C manggunoan masin FACSAria III (BD Biosains) jo parangkat lunak FACSDiva (BD Biosains, versi 8.0.1). Suspensi sel diuruik jo manggunoan nozzle 100 μm di bawah takanan 20 psi jo kacepatan ~2800 kajadian/detik. Karano kriteria gerbang tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, jo ciri-ciri hamburan) indak dapek mamastian isolasi PN nan tapek dari jinih sel lain, strategi gerbang diatur badasarkan pambandiangan langsuang intensitas YFP jo autofluoresensi pado mitoYFP+ ​​jo mitoYFP − kontrol. YFP dieksitasi jo caro manyinari sampel jo garih laser 488 nm, dan sinyalnyo dideteksi manggunoan saringan luluih pita 530/30 nm. Pado tikuih mitoYFP+, kakuatan relatif gen palaporan Rosa26-mitoYFP juo digunoan untuak mambedakan tubuah saraf jo pacahan akson. 7-AAD dieksitasi jo laser kuniang 561 nm dan dideteksi jo saringan lewat pita 675/20 nm untuak mangacualian sel-sel mati. Untuak mamisahkan astrosit pado wakatu nan samo, suspensi sel diwarnai jo ACSA-2-APC, kamudian sampel disinar jo garih laser 640 nm, jo ​​filter pita 660/20 nm digunoan untuak mandeteksi sinyal.
Sel-sel nan dikumpuakan dipelet jo caro sentrifugasi (1110 rpm, 5 minik, 4°C) jo disimpan pado suhu -80°C sampai dipakai. Tikuih Mfn2cKO jo anaknyo diklasifikasikan pado hari nan samo untuak maminimalikan variabilitas prosedural. Panyajian jo analisis data FACS dilakukan jo manggunoan perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Amerika Serikat).
Sarupo nan disabuikan di ateh (59), PCR wakatu nyato digunoan untuak mangisolasi DNA dari neuron nan diuruik untuak kuantifikasi mtDNA salanjuiknyo. Linieritas jo sensitivitas ambang batas awalnyo diuji jo manjalankan qPCR pado jumlah sel nan babeda. Singkeknyo, kumpuakan 300 PN dalam penyangga lisis nan tadiri dari tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween 20 0,5% jo proteinase K (200 ng/ml) dan inkubasi pado suhu 55°C salamo 120 minik. Sel-sel iko labiah lanjuik diinkubasi pado suhu 95°C salamo 10 minik untuak mamastian inaktivasi langkok proteinase K. Sains, nomor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Ilmiah Nelayan Termo, nomor katalog AIVI3E8) jo 18S (Ilmiah Nelayan Termo, nomor katalog Hs99999901_s1) gen.
Panyiapan sampel proteom. Dengan mamanehan larutan pado suhu 95 ° C salamo 10 minik jo disonikasi, dalam penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida jo 100 mM tris- Lise pelet dalam neuron beku]. Di Bioruptor (Diagenode) salamo 10 minik (denyut nadi 30 datiak / maso jeda 30 datiak). Sampel diencerkan 1:10 dalam tris-HCl 20 mM (pH 8,0), dicampua jo 300 ng ameh tripsin (Promega), jo diinkubasi samalam pado suhu 37°C untuak mancapai pancernaan langkok. Pado hari kaduo, sampel disentrifugasi pado 20.000 g salamo 20 minik. Supernatan diencerkan jo asam formik 0,1%, dan larutannyo dibuang garam jo StageTips nan dibuek surang. Sampel dikariangkan dalam instrumen SpeedVac (konsentrator Eppendorf ditambah 5305) pado suhu 45°C, dan kamudian peptida disuspensi dalam asam formik 0,1%. Sagalo sampel disusun sacaro sarantak dek urang nan samo. Untuak manganalisis sampel astrosit, 4 μg peptida nan dibuang garam diagiah label jo tag massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110, Ilmiah Termo Fisher) jo rasio peptida jo reagen TMT 1:20. Untuak pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT disuspensi ulang dalam 70 μl ACN anhidrat, dan peptida kariang direkonstitusi manjadi 9 μl TEAB 0,1 M (trietilamonium bikarbonat), nan ditambahkan 7 μl reagen TMT dalam ACN. Konsentrasinyo adolah 43,75%. Sasudah 60 minik inkubasi, reaksi dipadamkan jo 2 μl hidroksilamin 5%. Peptida nan diagiah label dikumpuakan, dikariangan, diasuspensi baliak dalam 200μl asam formik (FA) 0,1%, dibagi manjadi duo, dan kamudian dibuang garam manggunoan StageTips nan dibuek surang. Manggunoan kromatograf cairan kinerja ultra tinggi UltiMate 3000 (kromatograf cairan kinerja ultra tinggi UltiMate 3000), salah satu dari duo bagian difraksikan pado kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm nan diisi jo partikel C18 130Å1,7μm (No. Termo Nelayan Ilmiah). Pisahkan peptida jo laju aliran 30μl/min, pisahkan dari 1% inggo 50% penyangga B salamo 85 minik jo gradien batahap 96 minik, dari 50% inggo 95% penyangga B salamo 3 minik, kamudian 8 minik untuak 95 % Penyangga B; Penyangga A adolah ACN 5% jo amonium bikarbonat (ABC) 10 mM, sarato penyangga B adolah ACN 80% jo ABC 10 mM. Kumpuakan pecahan satiok 3 minik dan gabuangkan manjadi duo kalompok (1 + 17, 2 + 18, dll) dan kariangkan dalam sentrifugal vakum.
Analisis LC-MS/MS nan dilakukan. Untuak spektrometri massa, peptida (nomor r119.aq) dipisahkan pado kolom analitik PicoFrit diameter dalam 75 μm (lensa objektif baru, nomor bagian PF7508250) nan dilangkoki jo bahan ReproSil-Pur C12. 1200 (Ilmiah Nelayan Termo, Jerman). Kolom iko dipaliharo pado suhu 50°C. Penyangga A jo B adolah 0,1% asam formik dalam aia jo 0,1% asam formik dalam 80% ACN, masiang-masiang. Peptida dipisahkan jo gradien batahap 200 nl/min dari 6% inggo 31% penyangga B salamo 65 minik, jo dari 31% inggo 50% penyangga B salamo 5 minik. Peptida nan dielusi dianalisa pado spektrometer massa Fusi Orbitrap (Ilmiah Termo Fisher). Pangukuran m/z pandahulu peptida dilakukan jo resolusi 120.000 dalam kisaran 350 inggo 1500 m/z. Manggunoan energi tabrakan nan dinormalisasi 27%, prekursor paliang kuek jo kaadaan muatan 2 inggo 6 dipiliah untuak pambelahan disosiasi perangkap C (HCD) energi tinggi. Wakatu siklus diatur manjadi 1 s. Nilai m/z dari pacahan peptida diukua pado parangkap ion manggunoan target AGC paliang ketek 5×104 jo wakatu suntikan maksimum 86 ms. Sasudah dipacah-pacah, prekursor dilatakkan pado daftar pengecualian dinamis salamo 45 s. Peptida nan diagiah label TMT dipisahkan pado kolom PepMap Acclaim 50 cm, 75 μm (Ilmiah Termo Fisher, nomor katalog 164942), dan spektrum migrasi dianalisis pado spektrometer massa Tribrid Lumos Orbitrap (spektrometer massa Tribrid Lumos (Ilmiah Termo Fisher) (FAIMS) paralatan (Thermo Fisher Ilmiah) baoperasi pado duo tegangan kompensasi −50 jo −70 V. MS3 nan dipiliah badasarkan prekursor sinkronisasi digunoan untuak pangukuran sinyal ion laporan TMT. Pamisahan peptida dilakukan pado EASY-nLC 1200, manggunoan elusi gradien linier 90%, jo konsentrasi penyangga 6% inggo 31%; penyangga A adolah 0,1% FA, jo penyangga B adolah 0,1% FA jo 80% ACN. Kolom analisis dioperasikan pado suhu 50°C. Gunoan Gaya Bebas (versi 1.6, Ilmiah Nelayan Termo) untuak mambagi berkas asli sasuai jo tegangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi jo pangukuran protein. Manggunoan masin pancarian Andromeda nan terintegrasi, data aslinyo dianalisa manggunoan MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Salain urutan Cre rekombinase jo YFP nan didapek dari Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida dicari untuak urutan kanonik jo urutan isoform proteom acuan tikuih (ID Proteom UP000000589, diunduh dari UniProt pado bulan Mei2020). Oksidasi metionin jo asetilasi N-ujuang protein diatur sabagai modifikasi variabel; metilasi sistein karbamoil diatur sabagai modifikasi tatap. Parameter pencernaan diatur manjadi “spesifisitas” jo “tripsin/P”. Jumlah minimum peptida jo peptida silet nan digunoan untuak identifikasi protein adolah 1; jumlah minimum peptida unik adolah 0. Dalam kondisi pancocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein adolah 0,01. Pilihan “Peptida Kaduo” diaktifkan. Gunoan pilihan "cocokan antaro lari" untuak mamindahan identifikasi nan sukses antaro file asli nan babeda. Gunokan LFQ rasio minimum hitungan 1 untuak kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ disaring untuak sakurang-kurangnyo duo nilai nan sah pado sakurang-kurangnyo ciek kalompok genotipe pado satiok titiak wakatu, dan diekstrapolasi dari distribusi normal jo leba. 0,3 dan bapindah ka bawah 1,8. Gunoan platform komputasi Perseus jo R untuak manganalisis hasil LFQ. Uji t moderat duo arah dari paket perangkat lunak limma digunoan untuak analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksploratif dilakukan jo manggunoan ggplot, FaktoMiner, faktoekstra, GGally jo pheatmap. Data proteomik nan babasis TMT dianalisa manggunoan MaxQuant versi 1.6.10.43. Carilah data proteomik mentah dari basis data proteomik manusia UniProt, nan diunduh pado bulan September 2018. Analisisnyo tamasuak faktor koreksi kamurnian isotop nan disadiokan dek pambueknyo. Gunokan limma di R untuak analisis ekspresi perbedaan. Data asli, hasil pancarian basis data, jo alur karajo jo hasil analisis data sadonyo disimpan dalam aliansi ProteomeXchange malalui repositori mitra PRIDE jo pangidentifikasi himpunan data PXD019690.
Anotasi fungsional mampakayo analisis. Alat Analisis Jalur Kecerdasan (QIAGEN) digunoan untuak manantuan kekayaan istilah anotasi fungsional dari himpunan data pado 8 minggu (Gambar 1). Singkeknyo, daftar protein kuantitatif nan didapek dari analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) digunoan jo kriteria saringan barikuik: Mus musculus dipiliah sabagai spesies jo latar balakang, dan kategori manunjuakan nilai P nan disasuaikan dek Benjamini untuak pangayaan 0,05 atau labiah randah dianggap signifikan. Untuak grafik ko, limo kategori kalabihan paliang ateh pado satiok rumpun badasarkan nilai P nan disasuaikan ditunjuakan. Manggunoan babarapo uji t, manggunoan program dorongan linier duo tahap dari Benjamini, Krieger, jo Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein pajalanan wakatu dilakukan pado kandidat pantiang nan diidentifikasi dalam satiok kategori, jo satiok barih dianalisa sacaro tapisah. Indak paralu adopsi SD nan konsisten.
Untuak mambandiangkan hasil panalitian ko jo basis data nan dipublikasikan jo manghasilkan diagram Venn pado Gambar 1, kami manggabuangkan daftar protein kuantitatif jo anotasi MitoCarta 2.0 (24). Gunoan alat online Gambar Diagram Venn untuak manghasilkan diagram.
Untuak informasi rinci tantang prosedur statistik nan digunoan untuak analisis proteomik, silakan rujuak ka bagian Bahan jo Metode nan sasuai. Untuak sadoalah eksperimen lainnyo, informasi rinci dapek ditamukan pado tambo nan sasuai. Kacuali dinyatoan lain, sadoalah data dinyatoan sabagai rata-rata ± SEM, jo sadoalah analisis statistik dilakukan jo manggunoan parangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Untuak bahan tambahan untuak artikel ko, silakan caliak http://advances.sciencemag.org/cgi.
Iko adolah artikel akses tabukak nan didistribusikan di bawah syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, nan mamungkinkan panggunoan, distribusi jo reproduksi dalam media apo sajo, asalkan panggunoan akhia bukan untuak kauntuangan komersial dan premisnyo baso karya aslinyo batua. Reperensi.
Catatan: Kami hanyo mamintak Sanak untuak manyadiokan alamat email Sanak supayo urang nan Sanak rekomendasikan ka laman tu tahu baso Sanak nio inyo mancaliak email tu dan baso itu bukan spam. Kami indak akan manangkap alamat email apopun.
Pertanyaan ko digunoan untuak mauji apokah Sanak adolah pangunjuang dan mancagah pangiriman spam otomatis.
Dek E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Larson
Analisis proteomik saraf nan indak bafungsi mangungkapkan baso program metabolisme diaktifkan untuak manantang degenerasi saraf.
Dek E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Larson
Analisis proteomik saraf nan indak bafungsi mangungkapkan baso program metabolisme diaktifkan untuak manantang degenerasi saraf.
©2020 Asosiasi Amerika untuak Kamajuan Ilmu Pengetahuan. sagalo hak dilindungi. AAAS adolah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kamajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.