Kini†Alamat kini: OX11 0DE, Inggirih, Bangunan Intan, Taman Sains jo Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggirih, Sumber Cahayo Intan Co.
Pusat reaksi kompleks panen cahayo 1 (RC-LH1) adolah komponen fotosintesis inti dari bakteri fototrofik ungu. Kami mampakenalkan duo struktur mikroskopi krio-elektron dari kompleks RC-LH1 dari lumbuak. Struktur resolusi 2,65-Å dari kompleks RC-LH114-W tadiri dari 14 subunit loop LH1 nan mangaliliangi RC, nan diganggu dek protein W, sadangkan kompleks tanpa protein-W sapanuahnyo komposisi RC nan dikaliliangi dek RC. Ditutuik 16 subunit lingkaran LH1. Pabandiangan struktur iko mambarikan wawasan tantang dinamika kinon dalam kompleks RC-LH1, tamasuak parubahan konformasi nan sabalunnyo alun ditantuan katiko mangikek kinon pado situs QB RC, sarato lokasi situs mangikek kinon tambahan, nan mambantu Passnyo ka RC. Struktur unik protein W managah panutupan loop LH1, sahinggo mambuek saluran untuak mampacapek pertukaran kinon/kinolon.
Energi nan disadiokan dek fotosintesis dapek mampatahankan ampia sadoalah kahidupan di bumi, dan mampunyoi potensi gadang untuak bioteknologi surya. Sambia mampromosikan fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu juo mampanampakkan babagai mode energi jo kamampuan metabolisme. Inyo dapek mahindari fotosintesis jo tumbuah sabagai bakteri heterotrofik dalam kalam, dapek mameloki nitrogen jo karbondioksida, mangasiakan hidrogen, jo mandegradasi senyawa aromatik (1-3). Untuak manyadiokan energi untuak proses-proses iko, cahayo harus diubah sacaro capek jo efisien manjadi energi kimia. Proses iko dimulai katiko kompleks antena nan manjebak cahayo manyerap cahayo jo mamindahan energi nan takuruang ka pusat reaksi (RC), sahinggo dimulai pamisahan muatan (4 – 7). Unit dasar fotosintesis pado bakteri fototrofik ungu tadiri dari RC tipe 2, nan dikuliliangi dek kompleks panen cahayo 1 (LH1), mambantuak kompleks inti RC-LH1. LH1 tabantuak dek susunan heterodimer αβ nan malengkung, nan masiang-masiang mangikek duo molekul klorofil bakteri (BChl) jo ciek atau duo karotenoid (8-12). Antena LH1 nan paliang sederhana tadiri dari 16 atau 17 heterodimer αβ nan mangaliliangi RC (9-13) dalam loop tatutuik, tapi pado kompleks inti lainnyo, peptida transmembran mangganggu kasinambungan LH1 nan mangaliliangi , Jo caro iko mandorong difusi kinol/kinon jo kompleks bRC1, 13-15). Tumbuahan fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) adolah organisme model nan dapek mamahami pamindahan energi jo elektron nan mandukuang fotosintesis. Struktur kristal partamo Rps. Model kompleks RC-LH1 palustris adolah RC, nan dikuliliangi dek 15 loop LH1 heterodimer, nan diganggu dek protein nan indak dikatahui nan disabuik “Protein W” (14). Protein-W salanjuiknyo diidentifikasi sabagai RPA4402, nan marupokan protein 10,5kDa nan indak dicirikan jo tigo heliks transmembran (TMH) nan diprediksi (16). Kami mangusulkan untuak maubah namo gen nan manyandikan protein W manjadi pufW supayo sasuai jo nomenklatur nan digunoan untuak gen nan manyandikan subunit RC-L, M (pufL, pufM) jo LH1α, β (pufA, pufB). Nan menarik, protein-W hanyo ado pado sakitar 10% dari RC-LH1, mangungkapkan Rps. palustris mahasilkan duo kompleks RC-LH1 nan babeda. Di siko, kami malaporkan struktur krio-EM (krio-EM) resolusi tinggi dari duo kompleks inti, ciek jo protein W jo 14 heterodimer αβ, ciek lai tanpa protein W jo loop LH1 16 Heterodimer nan tatutuik. Struktur kami mawakili parubahan langkah dalam pamahaman kompleks RC-LH1 dari Rps. palustris, karano kami alah manganalisis populasi nan samo dari satiok varian jo mampunyoi resolusi nan cukuik untuak manatapkan sacaro jaleh satiok peptida jo pigmen nan takaik sarato lipid jo kinon nan takaik. Pabandiangan struktur iko manunjuakan baso tigo protein TMH-W nan alun ditamukan pado kompleks RC-LH1 lainnyo salamo ko manghasilkan saluran kinon untuak mampacapek pertukaran kinon/kinolon. Sajumlah tampek pangikek lipid jo kinon nan dikonservasi alah diidentifikasi, dan kami alah mangungkapkan parubahan konformasi baru sasudah kombinasi kinon jo RC, nan mungkin cocok untuak RC fotosistem II (PSII) dari organisme fototrofik nan baoksigen. Tamuan kami mambarikan wawasan baru tantang kinetika pangikatan jo panukaran kinon/kinolon pado kompleks inti RC-LH1 bakteri fototrofik ungu.
Untuak mamudahkan kajian nan rinci tantang kaduo kompleks nan tadapek di Rps. palustris, kami mangisolasi satiok RC-LH1 jo caro biokimia. Kompleks nan kakurangan protein W (salanjuiknyo disabuik ΔpufW) dimurnikan dari galur nan indak punyo gen pufW (16), dan hanyo ciek kompleks RC-LH1 nan dapek dihasiakan. Kompleks nan manganduang protein W dihasiakan dek strain. Protein W dari galur ko dimodifikasi jo tag His 10x pado ujuang C-nyo, sahinggo kompleks nan manganduang protein W dapek digabuangan sacaro efektif jo protein W nan paliang kurang jo caro mamobilisasi logam. Kompleks iko dipisahkan sacaro efektif (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Sarupo nan ditunjukkan pado Gambar 1, kaduo kompleks ko manganduang tigo sub-unit RC (RC-L, RC-M jo RC-H) nan dikuliliangi dek antena LH1. Struktur 2,80-A dari kompleks nan kurang protein-W manunjuakan 16 heterodimer αβ, mambantuak loop LH1 tatutuik nan sapanuahnyo mangaliliangi RC, salanjuiknyo disabuik sabagai kompleks RC-LH116. Struktur 2,65 Å dari kompleks nan manganduang protein-W mampunyoi LH1 heterodimer 14 nan diganggu dek protein-W, salanjuiknyo disabuik sabagai RC-LH114-W.
(A jo B) Pawakili permukaan dari senyawa. (C jo D) Pigmen nan takaik nan dinyatoan dalam batang. (E jo F) Kompleks nan diamati dari pamukoan sitoplasma mampunyoi peptida jo subunit LH1 nan diwakili dalam kartun, dan diagiah nomor saaraih jarum jam dari celah protein-W [sasuai jo panomoran Rba. kompleks sferoid (13)]. Untuak LH1-α, warna subunit protein adolah kuniang; untuak LH1-β, warna subunit protein adolah biru; untuak protein-W, protein tu bawarna sirah; untuak RC-H, adolah warna cyan; untuak RC-L, itu adolah Oranye; untuak RC-M, warna merah jambu. Kofaktor diwakili dek batang, warna hijau mawakili molekul BChl jo BPh a, ungu mawakili karotenoid, jo warna kuniang mawakili molekul UQ10. (G jo H) Pandangan nan diperbesar dari celah protein-W di daerah setara kompleks RC-LH114-W (G) jo kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor ditampilkan dalam bantuak pangisian ruang, kinon kelat ditampilkan jo warna biru. Celah protein-W disorot jo garih putus-putus biru pado (G), jo lubang-lubang ketek di mano kinon/kinolol manyebar pado cincin LH116 disorot jo garih putus-putus hitam pado (H).
Gambar 1 (A jo B) manunjuakan RC nan dikuliliangi dek susunan heterodimer LH1αβ tabukak atau tatutup, nan masiang-masiang mangikek duo BChl jo ciek karotenoid (Gambar 1, C jo D). Panalitian sabalunnyo manunjuakan baso Rps adolah kompleks LH1. Pado jalur biosintesis xantin spirulina, spesies ko manganduang populasi karotenoid nan bacampua (17). Namun, spiropiroksantin adolah karotenoid nan dominan jo kapadekannyo mamuaskan. Dek karano itu, kami mamiliah untuak mamodelkan spiroksantin pado sadoalah tampek pangikek LH1. Polipeptida alfa jo beta adolah TMH tungga jo daerah lua membran pendek (Gambar 1, A, B, E, jo F). Walaupun kapadekan 17 residu pado ujuang C indak diamati, polipeptida alfa dibelah dari Met1 manjadi Ala46 pado kaduo kompleks. polipeptida β dikurangi dari Gly4 manjadi Tyr52 pado RC-LH116, jo dari Ser5 manjadi Tyr52 pado RC-LH114-W. Indak ado kapadekan 3 atau 4 residu ujung N atau 13 residu ujung C nan diamati (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks RC-LH1 campuran nan disusun dari galur tipe liar manunjuakan baso daerah nan hilang adolah hasil dari pambelahan heterolog dari peptida-peptida ko (Gambar S1 jo S2). Formilasi N-ujuang α-Met1 juo diamati (f). Analisis manunjuakan baso α-peptida tadiri dari residu fMet1 sampai Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, jo β-peptida tadiri dari residu Ser2 sampai Ala53, nan sasuai bana jo peta kapadekan EM suhu randah.
Koordinasi α-Nyo29 jo β-Nyo36 mambuek BChls tatap muko; satiok heterodimer αβ marakit jo tatangganyo untuak mambantuak lingkaran tabukak (RC-LH114-W) atau lingkaran tatutuik (RC-LH116) di sakitar RC Array pigmen nan digabuangan eksiton (Gambar 1, C jo D). Dibandiangkan jo pita 877 nm dari RC-LH114-W, pergeseran merah serapan 880 nm dari RC-LH116 adolah 3 nm (Gambar 2A). Namun, spektrum dikroisme malingkar ampia samo (Gambar 2B), nan manunjuakan baso walaupun ado pabedaan nan jaleh antaro loop tabukak jo tatutup, lingkuangan lokal BChls sangaik mirip. Pergeseran merah panyarapan mungkin adolah akibaik dari panurunan gerak termal jo paningkekan stabilitas pado loop tatutuik (18, 19), parubahan panggabungan pigmen nan disababkan dek loop tatutuik (20, 21), atau kombinasi dari kaduo efek ko (11).
(A) Spektrum panyarapan ultraviolet/nampak/inframerah dakek, puncaknyo ditandoi jo pigmennyo nan sasuai dan dinormalisasi ka puncak BPh pado 775 nm. (B) Spektrum dikroisme lingkaran nan dinormalisasi untuak panyarapan BChl pado 805 nm. (C jo D) Spektrum ΔA nan dipiliah dari spektrum panyarapan nan disalasaikan wakatu dari kompleks RC-LH114-W (C) jo kompleks RC-LH116 (D). Untuak pambandiangan nan labiah baiak, sadoalah spektrum dinormalisasi manjadi ∆A dari −A pado 0,2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 sasudah iradiasi pado adonyo babagai konsentrasi UQ2 (caliak Gambar S8 untuak data mentah). (F) Pado sel nan tumbuah di bawah cahayo intensitas randah, sadang atau tinggi (10, 30 atau 300μMm-2 s-1, masiang-masiang), subunit protein W jo RC-L pado kompleks nan dimurnikan jo rasio membran nan tapisah. Tantukan kadar protein jo elektroforesis gel SDS-poliakrilamida jo imunoassai (caliak Gambar S9 untuak data mentah). Tantukan rasio relatif pado kompleks RC-LH114-W nan dimurnikan. Rasio stoikiometri RC-L jo protein-W dari kompleks adolah 1:1.
BChl pado posisi 1 pado loop αβ14 nan cacat dari RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, jo E) labiah dakek jo donor primer RC (P) jo 6,8 Å daripado BChl nan setara pado RC-LH116 (Gambar. 1, B, S3); namun, kinetika panyarapan panah dari kaduo kompleks manunjuakan baso untuak RC-LH114-W jo RC-LH116, konstanta wakatu pamindahan energi eksitasi dari LH1 ka RC adolah 40 ±4 jo 44±3 ps (Gambar 2). , C jo D, Gambar S4 jo Tabel S2). Indak ado pulo pabedaan nan signifikan dalam pamindahan elektronik dalam RC (Gambar S5 jo teks tambahan nan takaik). Kami curiga baso korespondensi dakek wakatu pamindahan energi antaro LH1 jo RC-P disababkan dek jarak, suduik jo energi potensial nan sarupo dari sabagian gadang BChl pado duo loop LH1. Tampaknyo manjalajah pola energi LH1 untuak mancapai jarak minimum indak labiah capek daripado pamindahan energi langsuang dari situs suboptimal ka RC. Loop LH1 loop tabukak pado RC-LH114-W dapek juo mangalami gerak termal nan indak signifikan dalam kondisi suhu randah untuak analisis struktural, dan ado konformasi cincin αβ14 nan labiah panjang pado suhu ruangan dari jarak pigmentasi βBChls pado posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 manganduang 32 BChl jo 16 karotenoid, jo susunannyo sacaro kasaluruahan samo jo nan didapek dari pidpidum Thermochromatium (Tch.) (12) jo ganggang hijau (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Sasudah panyalasaian, hanyo panyimpangan ketek pado posisi heterodimer αβ nan diamati, tarutamo 1-5, 15, jo 16 (Gambar S6). Adonyo protein-W mampunyoi dampak nan signifikan pado struktur LH1. Tigo TMH-nyo dihubuangkan jo loop pendek, jo ujuang N di sisi lumen kompleks jo ujuang C di sisi sitoplasma (Gambar 1A jo 3, A sampai D). Protein-W sabagian gadang hidrofobik (Gambar 3B), dan TMH2 jo TMH3 bainteraksi jo LH1αβ-14 untuak mambantuak pamukoan transmembran (Gambar 3, B jo E sampai G). Antarmukanyo tarutamo tadiri dari residu Phe, Leu jo Val di daerah transmembran. Residu-residu ko disusun jo asam amino hidrofobik jo pigmen αβ-14. Babarapo residu kutub juo manyumbang pado interaksi, tamasuak ikatan hidrogen antaro W-Thr68 jo β-Trp42 pado pamukaan rongga kompleks (Gambar 3, F jo G). Pado pamukoan sitoplasma, Gln34 badakek-an jo kalompok keto karotenoid αβ-14. Salain itu, molekul n-dodesil β-d-maltosida (β-DDM) disalasaian, jo ikua hidrofobiknyo malaweh ka antarmuka antaro protein-W jo αβ-14, jo ikua lipid mungkin talatak di dalam tubuah. Kami juo mamparatian baso daerah resolusi C-terminal protein W jo RCH sangaik dakek, tapi indak dalam lingkup pambentukan interaksi tatantu (Gambar 1, A jo E). Namun, mungkin ado interaksi pado asam amino C-terminal nan alun tasalasaian dari kaduo protein ko, nan mungkin manyadiokan mekanisme untuak parekrutan protein-W salamo panggabungan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, nan maadoki antarmuka jo LH1αβ14 dalam bantuak kartun, mampunyoi rantai sampiang babantuak batang (merah), nan ditampilkan pado bagian diagram potensial elektrostatik (pamukoan abu-abu tembus jo tingkek kontur 0,13). (B) Protein-W nan diwakili dek pamukoan nan bawarna hidrofobik. Daerah kutub jo bamuatan ditampilkan jo warna cyan, daerah hidrofobik ditampilkan jo warna putiah, jo daerah hidrofobik nan kuek ditampilkan jo warna oranye. (C jo D) Protein-W nan diwakili dalam kartun, orientasinyo samo jo pado (A) (C), jo diputa 180° (D). Manuruik posisi dalam urutan, residu nan dapek dibedakan maadopsi skema warna pelangi, di mano ujung N bawarna biru jo ujung C bawarna merah. (E) Protein-W dalam pandangan nan samo jo pado (A), jo residu pado antarmuka protein-W:LH1 diwakili dek batang jo tando nan dipasang. (F) Protein-W diputa 90° relatif pado (E) jo LH1αβ14 pado pawakilan kartun, jo relatif pado residu antarmuka pado pawakilan batang. Residu nan tagantuang dari polipeptida beta diagiah label. Kofaktor ditunjuakan sabagai batang nan sasuai jo warna Gambar 1, β-DDM nan terurai ditunjuakan jo warna abu-abu, jo oksigen ditunjuakan jo warna merah. (G) Pandangan pado (F) diputa 180°, jo residu nan manonjol dari polipeptida alfa nan diagiah label.
Protein-W manggantian heterodimer αβ (nan ka-15 pado Gambar 1F), sahinggo managah panutupan loop jo mamiringkan tigo heterodimer αβ partamo. Diamati baso suduik kemiringan maksimum heterodimer αβ-1 partamo relatif pado normal film adolah 25° sampai 29° (Gambar 1, A jo E), nan tabantuak dek kemiringan 2° sampai 8° αβ-1 pado RC A kontras tajam-LH116 jo F (Gambar 1, B). Heterodimer kaduo jo katigo masiang-masiang condong pado 12° inggo 22° jo 5° inggo 10°. Karano hambatan sterik RC, kamiringan αβ-1 indak tamasuak pasangan kaduo αβ (nan sasuai jo αβ ka-16 pado Gambar 1F), sahinggo mambantuak celah nan jaleh pado cincin LH1 (Gambar 1, A jo E) . Karano kurangnyo duo heterodimer αβ, diiriangi jo kahilangan ampek BChl jo duo karotenoid, indak ciek juo karotenoid nan mangikek pado subunit αβ-1 nan babelok, nan maakibaikan cincin LH114-W nan manganduang 13 karotenoid Vegetarian jo 28 BChl. Perkiraan resolusi lokal dari kaduo kompleks di daerah αβ1 sampai 7 labiah randah daripado sisa loop LH1, nan mungkin mancaminkan plastisitas nan melekat pado subunit LH1 nan badakek-an jo situs RC QB (Gambar 4) .
Gambar RC-LH114-W (A jo B) jo RC-LH116 (C jo D) ditunjuakan dari pandangan ateh/pandangan sampiang (A jo B) (A jo C) jo pamukoan rongga nan samo dari Gambar 1. (B jo D). Kunci nan bawarna ditunjuakkan di sabalah kanan.
Satu-satunyo kompleks inti nan khas lainnyo jo rasio stoikiometri 1:14 adolah dimer RC-LH1-PufX (13). Namun, protein W jo PufX indak punyo homologi nan jaleh, dan mampunyoi dampak nan signifikan pado struktur LH1 masiang-masiang. PufX adolah TMH tungga jo domain sitoplasma ujuang N nan bainteraksi jo sisi sitoplasma subunit RC-H (13) pado posisi nan sasuai jo Rps. 116αβ-16. PufX mambuek saluran untuak pertukaran kinon/kinolon antaro RC-LH1 jo kompleks sitokrom bcl dan ado pado saluruah Rba. kompleks inti sferoid (13). Walaupun antarmuka monomer-monomer ado di Rba. Dimer sferoid RC-LH1-PufX talatak pado posisi pangikek protein W pado RC-LH114-W, dan celah nan diinduksi dek PufX jo protein-W barado pado posisi nan satara (Gambar S7A). Celah pado RC-LH114-W juo sajalan jo saluran kinon hipotetis (8) dari Pseudomonas rosea LH1, nan tabantuak dek peptida nan indak takaik jo protein W atau PufX (Gambar S7B). Salain itu, saluran kinon di Blc. LH1 bawarna hijau zamrud nan tabantuak jo mangacualian ciek subunit γ (7) talatak pado posisi nan sarupo (Gambar S7C). Walaupun dimediasi dek protein nan babeda, muncuanyo saluran kinon/kinolol ko pado posisi nan samo pado kompleks RC-LH1 tampaknyo marupoan contoh evolusi konvergen, nan manunjuakan baso celah nan dibuek dek protein W mungkin batindak sabagai saluran kinon.
Celah pado loop LH114-W mamungkinkan pambentukan daerah membran nan taruih manaruih antaro ruang internal kompleks RC-LH114-W jo membran curah (Gambar 1G), daripado manyambuang kaduo domain malalui pori-pori protein sarupo pado protein. Kompleks RC-LH116 sarupo jo Tch nan tatutuik. Kompleks sarupo jarum (22) (Gambar 1H). Karano difusi kinon malalui membran labiah capek daripado difusi malalui saluran protein nan sampik, loop LH114-W tabukak dapek mamungkinkan omset RC nan labiah capek daripado loop LH116 nan tatutuik, jo difusi kinon ka dalam RC mungkin labiah dibatasi. Untuak mauji apokah protein W mampangaruahi konversi kinon malalui RC, kami malakuan uji oksidasi sitokrom pado konsentrasi tatantu ubikinon 2 (UQ2) (analog UQ10 alami jo ikua isopren nan labiah pendek) (Gambar 2E). Walaupun adonyo kinon kelat mahalangi panantuan akurat konstanta Michaelis nan tampak (RC-LH114-W jo RC-LH116 cocok untuak 0,2±0,1μM jo 0,5±0,2μM, masiang-masiang), tingkat maksimum RC-LH14-6-1. ± 5% labiah gadang daripado RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Kami awalnyo mampakiroan baso protein-W ado pado sakitar 10% dari kompleks inti (16); di siko, tingkat panduduak sel patumbuahan cahayo randah, cahayo sadang, jo cahayo tinggi adolah 15±0,6%, 11±1% jo 0,9±0,5, masiang-masiang % (Gambar 2F). Pabandiangan kuantitatif spektrometri massa manunjuakan baso panambahan tag histidin indak mangurangi kalimpahan relatif protein-W dibandiangkan jo strain tipe liar (P = 0,59), sahinggo tingkek-tingkek iko bukanlah artefak protein-W nan dimodifikasi (Gambar S10). Namun, panduduak protein-W nan randah pado kompleks RC-LH1 ko mungkin mamungkinkan babarapo RC untuak mambalik jo kacepatan nan dipercepat, sahinggo mangurangi pertukaran kinon/kinolon nan labiah lambek pado kompleks RC-LH116. Kami mamparatian baso tingkat pangunjuangan cahayo nan tinggi indak sasuai jo data transkriptomik nan baru-baru ko, nan manunjuakan baso ekspresi gen pufW maningkek di bawah cahayo nan kuek (Gambar S11) (23). Pabedaan antaro transkripsi pufW jo panggabungan protein-W ka dalam kompleks RC-LH1 mambuek binguang dan mungkin mancaminkan pangaturan kompleks protein.
Pado RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) jo 29 molekul β-DDM dialokasikan jo dimodelkan di dalamnyo 6 CDL, 24 POPC, 2 POPGβDM jo 12. RC-LH116 (Gambar 5, A jo B). Pado kaduo struktur ko, CDL ampia talatak di sisi sitoplasma kompleks, sadangkan POPC, POPG jo β-DDM kabanyakan talatak di sisi luminal. Duo molekul lipid jo deterjen diisolasi pado daerah αβ-1 sampai αβ-6 dari kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), jo limo diisolasi pado daerah setara RC-LH116 (Gambar 5B ). Labiah banyak lipid nan ditamukan di sisi lain kompleks, tarutamo CDL, nan takumpua antaro RC jo αβ-7 sampai αβ-13 (Gambar 5, A jo B). Lipid jo deterjen lain nan tasalasaian sacaro struktural talatak di lua cincin LH1, jo rantai asil nan tasalasaian jo baiak mamanjang antaro subunit LH1, nan samantaro ditantuan sabagai β-DDM pado RC-LH114-W, jo didefinisikan sabagai β-DDM pado RC A campuran βPOPC-DHDM jo 166. Posisi nan sarupo dari lipid kelat jo deterjen dalam struktur kito manunjuakan baso inyo marupoan tampek pangikek nan relevan sacaro fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul nan setara pado Tch juo mampunyoi konsistensi nan baiak. Lembut jo Trv. Galur 970 RC-LH1s (Gambar S12, B sampai E) (9, 12) jo residu ikatan hidrogen dari kalompok kapalo lipid manunjuakan konservasi nan cukuik baiak dalam panyalasaian urutan (Gambar S13), nan manunjuakan baso CDL nan dilestarikan nan maikek pado RC (24), situs-situs nan dikonservasi di
(A jo B) Peptida RC-LH114-W (A) jo RC-LH116 (B) diwakili dek kartun, jo pigmennyo diwakili dek batang, manggunoan skema warna pado Gambar 1. Lipid ditunjuakan jo warna merah, jo deterjen ditunjuakan jo warna abu-abu. UQ nan takaik jo situs RC QA jo QB bawarna kuniang, sadangkan UQ nan terisolir bawarna biru. (C jo D) Pandangan nan samo jo (A) jo (B), jo lipid nan dihilangkan. (E sampai G) Pandangan nan digadangkan dari Q1(E), Q2(F) jo Q3(G) dari RC-LH116, jo rantai sampiang nan saliang mampangaruahi. Ikatan hidrogen ditunjuakan sabagai garih putus-putus hitam.
Pado RC-LH116, baiak RC QA maupun QB UQ, nan ikuik dalam pamindahan elektron dalam proses pamisahan muatan, diuraikan pado tampek pangikekannyo. Namun, pado RC-LH114-W, kinon QB alun disalasaikan dan akan dibahas sacaro rinci di bawah ko. Salain kinon QA jo QB, duo molekul UQ nan dikelat (talatak di antaro cincin RC jo LH1) dialokasikan dalam struktur RC-LH114-W sasuai jo kalompok kapalonyo nan disalasaikan jo baiak (talatak di Q1 jo Q2, masiang-masiang). ruang). Gambar 5C). Duo unit isoprena ditugaskan untuak Q1, dan peta kapadekan manyalasaian 10 ikua isoprena langkok dari Q2. Dalam struktur RC-LH116, tigo molekul UQ10 nan dikelat (Q1 sampai Q3, Gambar 5D) disalasaikan, dan sadoalah molekul mampunyoi kapadekan nan jaleh di saluruah ikua (Gambar 5, D sampai G). Dalam kaduo struktur tu, posisi kalompok kapalo kinon Q1 jo Q2 mampunyoi konsistensi nan sangaik baiak (Gambar S12F), dan inyo hanyo bainteraksi jo RC. Q1 talatak di pintu masuak celah W RC-LH114-W (Gambar 1G jo 5, C, D jo E), dan Q2 talatak dakek tampek pangikek QB (Gambar 5, C, D) jo F). Residu L-Trp143 jo L-Trp269 nan dikonservasi sangaik dakek jo Q1 jo Q2 dan manyadiokan potensi interaksi π-susun (Gambar 5, E jo F, jo Gambar S12). L-Gln88, 3,0 Å dari oksigen distal Q1, manyadiokan ikatan hidrogen nan kuek (Gambar 5E); residu iko dikonservasi pado sado RC kacuali hubungan nan paliang jauah (Gambar S13). L-Ser91 digantian sacaro konservatif jo Thr pado sabagian gadang RC lainnyo (Gambar S13), adolah 3,8 Angstrom dari oksigen metil Q1, dan dapek manyadiokan ikatan hidrogen nan lamah (Gambar 5E). Q3 tampaknyo indak mampunyoi interaksi spesifik, tapi talatak di daerah hidrofobik antaro subunit RC-M jo subunit LH1-α 5 sampai 6 (Gambar 5, D jo G). Q1, Q2 jo Q3 atau kinon kelat dakeknyo juo alah disalasaikan pado Tch. Lembut, Trv. Galur 970 jo Blc. Struktur iris (9, 10, 12) manunjuak ka tampek pangikek kinon tambahan nan dikonservasi pado kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Limo UQ nan diuraikan pado RC-LH116 sasuai bana jo 5,8±0,7 dari satiok kompleks nan ditantukan jo kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC), sadangkan tigo UQ nan diuraikan pado RC-LH114-W labiah randah daripado Nilai nan diukua dari molekul 6,2±0,3 ado manunjuakan S4. struktur.
Polipeptida L jo M pseudo-simetris masiang-masiang manganduang limo TMH jo mambantuak heterodimer nan manggabuangkan ciek dimer BChl, duo monomer BChl, duo monomer bakteriofag (BPh), jo ciek zat besi non- Heme sarato ciek atau duo molekul UQ10. Malalui adonyo ikatan hidrogen pado gugus keton terminal jo akumulasinyo nan dikatahui pado Rps, karotenoid dimasuakan dalam subunit M, nan dinamoi cis-3,4-dehidroorhodopin. Jinih (25) nan ado. Domain membran lua RC-H dijangkau pado membran dek TMH tungga. Struktur RC sacaro kasaluruahan sarupo jo tigo subunit RC dari spesies nan takaik (sarupo Rba). sferoid (ID PDB: 3I4D). Makrosiklus BChl jo BPh, tulang pungguang karotenoid jo besi non-hem tumpang tindih dalam jangkauan resolusi struktur ko, baitu juo jo kalompok kapalo UQ10 pado situs QA jo kinon QB pado RC-LH116 (Gambar S15).
Kasadioan duo struktur RC jo tingkat panghunian situs QB nan babeda mambarikan kasampatan baru untuak mamareso parubahan konformasi nan konsisten nan mangiriangi pangikatan kinon QB. Pado kompleks RC-LH116, kinon QB talatak pado posisi “proksimal” nan takaik sapanuahnyo (26), tapi pamisahan RC-LH114-W indak mampunyoi kinon QB. Indak ado kinon QB pado RC-LH114-W, nan mangajuikkan karano kompleksnyo aktif, labiah dari kompleks RC-LH116 jo kinon QB nan disalasaikan sacaro struktural. Walaupun kaduo cincin LH1 mangalat sakitar anam kinon, limo disalasaikan sacaro struktural pado cincin RC-LH116 nan tatutuik, sadangkan hanyo tigo nan tabateh sacaro struktural pado cincin RC-LH114-W tabukak . Paningkekan gangguan struktural ko mungkin mancaminkan panggantian situs QB RC-LH114-W nan labiah capek, kinetika kinon nan labiah capek di kompleks, jo paningkekan kamungkinan untuak malintasi loop LH1. Kami manyarankan bahaso kurangnyo UQ di situs QB RC RC-LH114-W mungkin adolah akibaik dari kompleks nan labiah kompleks dan labiah aktif, dan situs QB RC-LH114-W alah langsuang dibekukan dalam omset UQ Tahap spesifik (pintu masuak ka situs QB alah ditutuik a konformasi ref.
Tanpa QB, rotasi nan mairiangi L-Phe217 ka posisi nan indak sasuai jo pangikatan UQ10, karano akan manyababkan tabrakan spasial jo unit isopren partamo ikua (Gambar 6A). Salain itu, parubahan konformasi utamo nan jaleh jaleh, tarutamo heliks de (heliks pendek dalam loop antaro TMH D jo E) dimano L-Phe217 digeser ka saku pangikek QB jo rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A ) Untuak mamutuihkan ikatan hidrogen jo rangka pangikek M5 dari M-4. tampeknyo (Gambar 6B). Heliks de baputa pado dasarnyo, Cα dari L-Ser209 bageser 0,33Å, sadangkan L-Val221Cα bageser 3,52Å. Indak ado parubahan nan dapek diamati pado TMH D jo E, nan dapek dilapisi pado kaduo struktur (Gambar 6A). Satau kami, iko adolah struktur partamo di RC alami nan manutup situs QB. Pabandiangan jo struktur langkok (taikat QB) manunjuakan baso sabalun kinon bakurang, parubahan konformasi diparaluan untuak mambueknyo masuak ka dalam kinon. L-Phe217 baputa untuak mambantuak interaksi π-panyumpukan jo kalompok kapalo kinon, jo heliks bageser ka lua, nan mamungkinkan rangka L-Gly222 jo rantai sampiang L-Tyr223 untuak mambantuak jaringan ikatan hidrogen jo struktur ikatan hidrogen nan stabil (Gambar 6, A jo C).
(A) Kartun tumpang tindih dari hologram (rantai L, rantai oranye/M, magenta) jo struktur apo (abu-abu), di mano residu kunci dipajang dalam bantuak gambaran sarupo batang. UQ10 diwakili jo bar kuniang. Garih titiak-titik manunjuakan ikatan hidrogen nan tabantuak pado saluruah struktur. (B jo C) Pawakili pamukoan apolipoprotein jo saluruah struktur cincin, manyoroti oksigen rantai sampiang L-Phe217 jo warna biru jo L-Tyr223 jo warna merah, masiang-masiang. Subunit L bawarna oranye; subunit M jo H indak bawarna. (D jo E) Situs QB RC apolipoprotein (D) jo saluruah (E) [warna jo (A) masiang-masiang] jo Termofil termofil PSII (hijau, biru jo kinon plastik; ID PDB: 3WU2) Jajarkan (58).
Indak disangko-sangko, walaupun babarapo struktur RC nan defisiensi QB tanpa LH1 tasadio, parubahan konformasi nan diamati dalam panalitian ko alun dilaporkan sabalunnyo. Iko tamasuak struktur kehabisan QB dari Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Cak. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) jo Rba. (29), nan kasadonyo ampia samo jo struktur QBnyo sacaro kasaluruahan. Pamariksaan dakek pado 3PRC mangungkapkan baso molekul deterjen LDAO (Lauril Dimetil Amina Oksida) maikek pado pintu masuak posisi QB, nan mungkin managah susunan ulang manjadi konformasi nan tatutuik. Walaupun LDAO indak mangurai pado posisi nan samo pado 1EYS atau 1OGV, RC ko disiapkan manggunoan deterjen nan samo dan karano itu dapek mahasilkan efek nan samo. Struktur kristal dari Rba. Sferoid RC nan dikristal basamo jo sitokrom c2 (ID PDB: 1L9B) juo tampaknyo mampunyoi situs QB nan tatutuik. Namun, dalam hal iko, daerah N-terminal polipeptida RC-M (bainteraksi jo tampek pangikek QB malalui ikatan H residu Tyr pado heliks Q) maadopsi konformasi nan indak alami, jo parubahan konformasi QB indak digali labiah lanjuik (30 ). Nan mananangan hati adolah kito alun mancaliak deformasi polipeptida M bantuak iko dalam struktur RC-LH114-W, nan ampia samo jo daerah N-terminal RC-LH116 RC. Paralu juo dicaliak baso sasudah pambasmian antena LH1 nan babasis deterjen, RC apolipoprotein dalam PDB disalasaikan, nan manghilangkan kolam kinon jo lipid dalam celah antaro RC jo pamukaan dalam cincin LH1 di sakitarnyo (31, 32). RC tatap bafungsi karano mampatahankan sadoalah kofaktor, kacuali kinon QB nan dapek diuraikan, nan kurang stabil jo acok hilang salamo proses panyiapan (33). Salain itu, dikatahui baso pangapuangan LH1 jo lipid siklik alami dari RC dapek maagiah dampak pado fungsi, sarupo maso iduik nan disingkek dari kaadaan P+QB nan tapisah jo muatan (31, 34, 35). Dek karano itu, kami baspekulasi bahaso adonyo cincin LH1 lokal nan mangaliliangi RC mungkin mampatahankan situs QB nan “tatutuik”, sahinggo mampatahankan lingkungan lokal dakek QB.
Walaupun apolipoprotein (tanpa kinon QB) jo struktur langkok hanyo mawakili duo gambaran dari omset situs QB, bukan sarangkaian kajadian, ado indikasi baso pangikatan dapek digate untuak mancagah pangikatan baliak dek hidrokinon Untuak mangambati panghambatan substrat. Interaksi kinolol jo kinon dakek situs QB apolipoprotein mungkin babeda, nan manyababkan panulakannyo dek RC. Alah lamo diusulkan baso parubahan konformasi baparan dalam pangikatan jo pangurangan kinon. Kamampuan RC nan beku untuak mangurangi kinon sasudah adaptasi kalam rusak (36); Kristalografi sinar-X manunjuakan baso karusakan ko disababkan dek kinon QB nan takuruang dalam konformasi “distal” sakitar 4,5 Å dari posisi proksimal aktif (26) , 37). Kami manyarankan baso konformasi pangikek distal ko marupoan gambaran dari kaadaan antaro apolipoprotein jo struktur cincin panuah, nan mangikuti interaksi awal jo kinon jo pambukaan situs QB.
RC tipe II nan tadapek pado kompleks PSII bakteri fototrofik jo bakteri siano tatantu, ganggang jo tumbuahan mampunyoi konservasi struktural jo fungsional (38). Panyalasaian struktural nan ditunjukkan pado Gambar 6 (D jo E) manakankan kasamoan antaro RC PSII jo situs QB kompleks RC bakteri. Pabandiangan iko alah lamo manjadi model untuak mampalajari sistem pangikatan jo pangurangan kinon nan bakaik dakek. Publikasi sabalunnyo manyarankan baso parubahan konformasi diiriangi jo pangurangan PSII kinon (39, 40). Dek karano itu, maanggap konservasi evolusioner RC, mekanisme pangikek nan sabalunnyo alun diamati ko mungkin juo balaku untuak situs QB PSII RC pado tumbuahan fototrofik nan baoksigen.
Rps ΔpufW (panghapusan pufW nan indak diagiah label) jo PufW-Nyo (ujuang C 10x protein-W nan diagiah label nan dinyatoan dari lokus pufW alami). palustris CGA009 alah dijalehan dalam karya kami sabalunnyo (16). Strain iko jo induak tipe liar isogenik dipuliahan dari kulkas beku jo caro manggaris sajumlah ketek sel pado PYE (masing-masing 5 g liter -1) (disimpan dalam LB pado suhu -80 °C, manganduang 50% ( w/v) protein gliserol, ekstrak ragi jo suksinat (% agar/w). Piring diinkubasi samalam dalam kalam pado suhu ruangan dalam kondisi anaerob, dan kamudian ditarangkan jo cahayo putiah (~50 μmolm-2 s-1) nan disadiokan dek bohlam halogen OSRAM 116-W (Komponen RS, Inggirih) salamo 3 inggo 5 hari sampai muncua satu koloni. Sabuah koloni tungga digunoan untuak maninokulasi 10 ml media M22+ (41) nan ditambahi jo 0,1% (w/v) asam kasamino (salanjuiknyo disabuik M22). Kultur tumbuah dalam kondisi oksigen randah dalam kalam pado suhu 34°C jo digoyang-goyang pado 180 rpm salamo 48 jam, dan kamudian 70 ml kultur diinokulasikan dalam kondisi nan samo salamo 24 jam. Kultur satangah aerobik jo volume 1 ml digunoan untuak maninokulasi 30 ml media M22 dalam botol kaco tembus universal 30 ml dan disinari jo agitasi (~50μmolm-2 s-1) salamo 48 jam jo gaya magnet steril Batang pangadukan. Kudian 30 ml dari kultur diinokulasi jo sakitar 1 liter kultur dalam kondisi nan samo, nan kamudian digunoan untuak diinokulasi sakitar 9 liter kultur nan diterangi pado ~200 μmolm-2 s-1 salamo 72 jam. Sel-sel dipanen jo caro sentrifugasi pado suhu 7132 RCF salamo 30 minik, diasuspensi baliak dalam ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0), jo disimpan pado suhu -20°C sampai diparaluan.
Sasudah dicairkan, tambahkan babarapo kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggirih), lisozim (Merck, Inggirih) jo duo tablet panghambat protease holoenzim Roche (Merck, Inggirih) ka sel-sel nan disuspensi baliak. Dalam sel takanan Parancih 20.000 psi (Aminco, Amerika Serikat), sel-sel tu taganggu 8 inggo 12 kali. Sasudah mangaluaan sel-sel nan alun pacah jo puing-puing nan indak laruik jo sentrifugasi pado 18.500 RCF salamo 15 minik pado suhu 4°C, membran diendapkan dari lisaat nan bapigmen jo sentrifugasi pado 113.000 RCF salamo 2 jam pado suhu 43.000°C. Buang fraksi nan laruik dan disuspensikan baliak membran nan bawarna dalam 100 inggo 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) dan homogenkan sampai indak ado agregat nan tampak. Membran nan tasuspensi diinkubasi dalam tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, Amerika Serikat) nan manganduang β-DDM 2% (w/v) salamo 1 jam dalam kalam pado suhu 4°C jo pangadukan lembut. Kudian sentrifugasi pado suhu 70°C untuak malaruikkan 150.000 RCF pado suhu 4°C salamo 1 jam untuak maapuih siso-siso nan indak laruik.
Membran palaruik dari galur ΔpufW dilakekkan pado kolom panukaran ion Sefarosa DEAE 50 ml jo tigo volume kolom (CV) penyangga pangikek [20 mM tris-HCl (pH 8,0) nan manganduang 0,03% (w / v) β-DDM]. Cuci kolom jo duo penyangga pangikek CV, dan kamudian cuci kolom jo duo penyangga pangikek nan manganduang NaCl 50 mM. Kompleks RC-LH116 dielusi jo gradien linier 150 inggo 300 mM NaCl (dalam penyangga pangikek) pado 1,75 CV, jo kompleks pangikek nan tasiso dielusi jo penyangga pangikek nan manganduang NaCl 300 mM pado 0,5 CV. Kumpuakan spektrum panyarapan antaro 250 jo 1000 nm, simpan fraksi jo rasio panyarapan (A880/A280) labiah gadang dari 1 pado 880 inggo 280 nm, encerkan duo kali dalam penyangga pangikek, jo gunoan prosedur nan samo baliak pado kolom DEAE Pado pamurnian. Encerkan pecahan jo rasio A880/A280 labiah tinggi dari 1,7 jo rasio A880/A805 labiah tinggi dari 3,0, lakukan putaran katigo pertukaran ion, jo pertahankan pecahan jo rasio A880/A280 labiah tinggi dari 2,2 jo rasio A880/A805 labiah tinggi dari.0. Kompleks nan dimurnikan sabagian dikonsentrasikan sampai ~2 ml dalam saringan sentrifugal cut-off barek molekuler Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, Inggris), dan dimuek pado kolom pengecualian ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, AS) nan manganduang penyangga NaC m 1,5 CV. Kumpuakan spektrum panyarapan dari fraksi pengecualian ukuran, dan konsentrasikan spektrum panyarapan jo rasio A880/A280 di ateh 2,4 dan rasio A880/A805 di ateh 5,8 sampai 100 A880, dan langsuang gunoan untuak panyiapan atau panyimpanan kisi krio-TEM Simpan pado -C°8.
Membran palaruik dari galur PufW-Nyo diaplikasikan pado kolom Sefarosa Ni-Nta HisPrep 20 ml (tris-HCl 20 mM (pH 8,0) nan manganduang NaCl 200 mM jo 0,03% (b/b)) dalam penyangga IMAC Kesehatan ( GEca). v) β-DDM]. Kolom dibasuah jo limo CV penyangga IMAC, dan kamudian jo limo CV penyangga IMAC nan manganduang histidin 10 mM. Kompleks inti dielusi dari kolom jo limo penyangga IMAC nan manganduang histidin 100 mM. Fraksi nan manganduang kompleks RC-LH114-W dikonsentrasikan sampai ~10 ml dalam tangki nan diaduk nan dilangkoki jo saringan Amicon 100.000 MWCO (Merck, Inggris), diencerkan 20 kali jo penyangga pangikek, dan kamudian ditambahkan ka 25 ml talabiah dahulu. Cuci kolom jo ampek penyangga pangikek CV, kamudian eluasi kompleks pado lapan CV pado gradien linier 0 sampai 100 mM NaCl (dalam penyangga pangikek), dan ampek CV nan tasiso manganduang penyangga pangikek 100 mM Kompleks residu dieluasi jo komri8A20. labiah tinggi dari 2,4 dan rasio A880/A805 labiah tinggi dari 4,6 fraksi dikonsentrasikan sampai ~2 ml dalam saringan sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, dan diisi jo IMAC 1,5 CV talabiah dahulu Penyangga diimbangi Superdex 200 nan diasiangkan dalam penyangga 16/600. 1,5 CV. Kumpuakan spektrum panyarapan dari fraksi ukuran-eksklusi dan konsentrasikan spektrum panyarapan jo rasio A880/A280 labiah dari 2,1 jo rasio A880/A805 labiah dari 4,6 sampai 100 A880, nan langsuang digunoan untuak panyiapan kisi TEM beku atau disimpan pado paralu -80°C.
Sabuah beku panyelaman Leica EM GP digunoan untuak manyiapkan kisi-kisi TEM suhu randah. Kompleks iko diencerkan dalam penyangga IMAC manjadi A880 dari 50, dan kamudian 5μl dimuek ka jalo timbago nan baru dibuang jo cahayo QUANTIFOIL 1,2/1,3 nan balapis karbon (Agar Ilmiah, Inggirih). Inkubasi kisi pado suhu 20°C jo kalembaban relatif 60% salamo 30 s, kamudian blot kariang salamo 3 s, dan kamudian padamkan dalam etan cair pado suhu -176°C.
Data dari kompleks RC-LH114-W dicatat pado eBIC (Pusat Bioimaging Elektronik) (Sumber Cahayo Berlian Inggirih) jo mikroskop Titan Krios, nan bakarajo pado tegangan percepatan 300kV, jo pabesaran nominal Choose energi 130.000 dari-V jo an Sabuah Kuantum GIF Gatan 968 jo detektor puncak K2 digunoan untuak mancataik gambar dalam mode maetong untuak mangumpuakan data. Ukuran piksel nan dikalibrasi adolah 1,048Å, jo tingkat dosis adolah 3,83 e-Å-2s-1. Dikumpuakan pilem tu dalam wakatu 11 datiak dan dibagi manjadi 40 bagian. Gunoan daerah nan balapis karbon untuak mafokuskan baliak mikroskop, dan kamudian mangumpuakan tigo film per lubang. Sacaro kasaluruahan, 3130 film dikumpuakan, jo nilai defokus antaro -1 jo -3μm.
Data untuak kompleks RC-LH116 dikumpuakan manggunoan mikroskop nan samo di Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggirih). Data dikumpuakan dalam mode maetong jo pabesaran 130 k, jo ukuran piksel dikalibrasi manjadi 1,065 Å jo dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film ko direkam dalam wakatu 12 datiak dan dibagi manjadi 48 bagian. Sacaro kasaluruahan, 3359 film dikumpuakan, jo nilai defokus antaro -1 jo -3μm.
Sagalo pamrosesan data dilakukan dalam jalur pipa Relion 3.0 (42). Gunokan Gerakkorr 2 (43) untuak mangoreksi gerak balok jo panimbangan dosis, dan kamudian gunoan CTFARIK 4.1 (44) untuak manantuan parameter CTF (fungsi pamindahan kontras). Fotomikrograf khas sasudah tahap pamrosesan awal ko ditunjuakan pado Gambar 2. S16. Cetakan pamiliahan otomatis dihasiakan jo mamiliah sacaro manual sakitar 250 piksel dari 1000 partikel dalam bingkai 250 piksel jo indak ado acuan klasifikasi duo dimensi (2D), sahinggo manulak klasifikasi-klasifikasi nan mamanuahi kontaminasi sampel atau indak punyo ciri-ciri nan dapek dicaliak. Kudian, pamiliahan otomatis dilakukan pado sadoalah mikrofoto, jo RC-LH114-W adolah 849.359 partikel, jo kompleks RC-LH116 adolah 476.547 partikel. Sagalo partikel nan dipiliah alah manjalani duo putaran klasifikasi 2D non-acuan, dan sasudah satiok lari, partikel nan mamanuahi luas karbon, kontaminasi sampel, indak ado ciri nan jaleh atau partikel nan batumpuak kuek ditulak, nan maakibaikan 772.033 (90,9%) jo 359.678 partikel untuak panggunoan D 578 ( ) RC-LH114-W jo RC-LH116 masiang-masiang. Model acuan 3D awal dihasiakan jo manggunoan metode panurunan gradien stokastik. Manggunoan model awal sabagai acuan, partikel-partikel nan dipiliah diklasifikasikan manjadi ampek kategori dalam 3D. Manggunoan model dalam kategori iko sabagai acuan, lakukan panyulingan 3D pado partikel-partikel dalam kategori tagadang, kamudian manggunoan filter lulus randah 15Å awal untuak manutuik daerah pelarut, tambahkan 6 piksel dari sisi lunak, jo pasca-proses piksel untuak mangoreksi fungsi transfer Gatan K2 puncak puncak Mo. Untuak kumpulan data RC-LH114-W, model awal ko dimodifikasi jo maapuih kapadekan nan kuek pado tapi-tapi topeng (diputuihkan dari kapadekan kompleks inti pado Chimera UCSF). Model nan dihasiakan (resolusi RC-LH114-W jo RC-LH116 adolah 3,91 jo 4,16 Å, masiang-masiang) digunoan sabagai acuan untuak putaran kaduo klasifikasi 3D. Partikel-partikel nan digunoan dikalompokkan ka dalam kelas 3D awal dan indak manganduang korelasi nan kuek jo lingkungan. Tumpang tindih atau kurangnyo ciri struktural nan jaleh. Sasudah putaran kaduo klasifikasi 3D, kategori jo resolusi tatinggi dipiliah [Untuak RC-LH114-W, ciek kategori adolah 377.703 partikel (44,5%), untuak RC-LH116, ado duo kategori katiko hanyo ado duo kategori, sabanyak 260.752 partikel adolah7me. sasudah rotasi awal jo pabedaan ketek]. Partikel-partikel nan dipiliah diekstraksi ulang dalam kotak 400 piksel dan dihaluskan jo pamurnian 3D. Topeng pelarut dihasiakan manggunoan filter lulus randah 15Å awal, ekspansi peta 3 piksel jo topeng lunak 3 piksel. Manggunoan pamurnian CTF per-partikel, koreksi gerak per-partikel jo putaran kaduo pamurnian CTF per-partikel, pamurnian 3D, panyamakan pelarut jo pasca-pangolahan dilakukan sasudah satiok langkah untuak labiah mampaelok-i tekstur nan dihasilkan. Manggunoan nilai potong FSC (Koefisien Korelasi Cangkang Fourier) 0,143, resolusi model akhia RC-LH114-W jo RC-LH116 masiang-masiang adolah 2,65 jo 2,80Å. Kurva FSC dari model akhir ditunjuakan pado Gambar 2. S17.
Sagalo urutan protein diunduh dari UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; Satu ProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID Protein Satu: Q6N1K3). MODEL-Swiss (45) digunoan untuak mambangun model homologi RC, nan manganduang urutan protein RC-L, RC-M jo RC-H sarato struktur kristal Rba. RC digunokan sabagai cetakan (ID PDB: 5LSE) (46). Gunokan alat “peta pas” di Chimera UCSF untuak mancocokan model nan dihasiakan jo peta (47), maningkekan struktur protein, jo kofaktor [4×BChl a (namo residu pustaka monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), ciek atau duo jinih UQ10 (U10), ciek iron non-heme) 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] manggunoan Coot (48) untuak manambah. Karano QAK indak tasadio di pustaka monomer, mako diparameterkan jo manggunokan alat eLBOW di PHENIX (49).
Salanjuiknyo, subunit LH1 dibangun. Pado mulonyo, alat konstruksi otomatis di PHENIX (49) digunoan untuak mambangun sabagian dari urutan LH1 sacaro otomatis manggunoan peta jo urutan protein LH1-α jo LH1-β sabagai masuak. Piliah subunit LH1 nan paliang langkok, ekstrak dan muek ka dalam Coot, sacaro manual tambahkan urutan nan hilang di dalamnyo, dan sacaro manual mampaelok-i saluruah struktur sabalun manambahkan duo BCl a (BCL) jo spiriloksantin (CRT) [manuruik Rps nan takaik Kapadekan kompleks LH1 jo kanduangan karotenoid nan dikatahui. Jinih (17)]. Salin subunit LH1 langkok, dan gunokan “Alat Peta Dok” Chimera UCSF untuak malabuh di daerah non-model nan badakek-an jo kapadekan LH1, dan kamudian disampurnakan di Coot; ulangi proses sampai sado subunit LH1 alah dimodelkan. Untuak struktur RC-LH114-W, jo maekstraksi kapadekan nan indak dialokasikan pado Coot, protein dibagi dari komponen non-protein nan tasiso dalam peta Chimera USCF jo alat Autobuild digunoan untuak managakkan model awal, jo subunit nan tasiso (protein-W) Pemodelan. Nan di FENIS (49). Tambahkan urutan apo sajo nan hilang pado model nan dihasilkan di Coot (48), dan kamudian sacaro manual mampaelok saluruah subunit. Kapadekan nan indak dialokasikan nan tasiso sasuai jo kombinasi lipid (ID pustaka monomer PDB dari CDL = CDL, POPC = 6PL jo POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) jo molekul UQ10 (U10). Gunoan optimasi PHENIX (49) jo optimasi manual di Coot (48) untuak manyamparonoan model awal nan langkok sampai statistik model jo kualitas visual dari pas indak dapek ditingkatkan labiah lanjuik. Akhianyo, gunoan LocScale (50) untuak maasah peta lokal, dan kamudian malakukan babarapo siklus lain dari pamodelan kapadekan nan indak dialokasikan jo optimasi otomatis jo manual.
Peptida, kofaktor jo lipid jo kinon lainnyo masiang-masiang nan balabuh dalam kapadekan masiang-masiang ditunjuakan pado Gambar 1 jo 2. S18 sampai S23. Informasi statistik dari model akhia ditunjuakan pado Tabel S1.
Kacuali dinyatoan lain, spektrum panyarapan UV/Vis/NIR dikumpuakan pado spektrofotometer Cary60 (Agilent, Amerika Serikat) pado jarak 1 nm dari 250 nm inggo 1000 nm jo wakatu integrasi 0,1s.
Encerkan sampel dalam kuvet kuarsa jo jalur 2 mm ka A880 dari 1, dan kumpuakan spektrum panyarapan antaro 400 jo 1000 nm. Spektrum dikroik malingkar dikumpuakan pado spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Japang) pado jarak 1 nm antaro 400 nm jo 950 nm jo kacepatan pindaian 20 nm min-1.
Koefisien kapunahan molar ditantuan jo caro mancairkan kompleks inti manjadi A880 kiro-kiro 50. Encerkan volume 10μl dalam penyangga pangikek atau metanol 990μl, jo kumpuakan spektrum panyarapan sacaro langsuang untuak maminimalikan degradasi BChl. Kanduangan BChl dari satiok sampel metanol dihituang jo koefisien kapunahan pado 771 nm yaitu 54,8 mM-1 cm-1, dan koefisien kapunahan ditantuan (51). Bagi konsentrasi BChl nan diukua jo 32 (RC-LH114-W) atau 36 (RC-LH116) untuak manantuan konsentrasi kompleks inti, nan kamudian digunoan untuak manantuan spektrum panyarapan dari sampel nan samo nan dikumpuakan dalam Koefisien Kapunahan penyangga. paralel. Tigo kali pangukuran baulang diambiak untuak satiok sampel, jo absorbansi rato-rato maksimum BChl Qy digunoan untuak paretongan. Koefisien kapunahan RC-LH114-W nan diukua pado 878 nm adolah 3280±140 mM-1 cm-1, sadangkan koefisien kapunahan RC-LH116 nan diukua pado 880 nm adolah 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 diukua sasuai jo caro pado (52). Singkeknyo, HPLC fase tabaliak (RP-HPLC) dilakukan jo manggunoan sistem HPLC Agilent 1200. Laruikkan sakitar 0,02 nmol RC-LH116 atau RC-LH114-W dalam 50μl metanol:kloroform 50:50 nan manganduang 0,02% (b/v) klorida besi, dan suntikkan Larutan Beckman Coulter nan alah diimbangi sabalunnyo pado ODS min-1. 40°C dalam pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) pado kolom ×25 cm. Lakuan eluasi isokrat dalam palaruik HPLC untuak mamantau absorbansi pado 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) jo 780 nm (BChl) salamo 1 jam. Puncak pado kromatogram 275 nm pado 25,5 minik diintegrasikan, nan indak manganduang senyawa lain nan dapek dideteksi. Daerah nan terintegrasi digunoan untuak mahituang jumlah mol UQ10 nan diekstraksi jo acuan kurva kalibrasi nan dihituang dari injeksi standar murni dari 0 sampai 5,8 nmol (Gambar S14). Satiok sampel dianalisa dalam tigo ulangan, dan kasalahan nan dilaporkan sasuai jo SD dari rato-rato.
Larutan nan manganduang kompleks RC-LH1 jo panyarapan Qy maksimum 0,1 disusun jo 30 μM sitokrom jantuang kudo nan dikurangi c2 (Merck, Inggirih) jo 0 inggo 50 μMUQ2 (Merck, Inggirih). Tigo sampel 1-ml disiapkan pado satiok konsentrasi UQ2 jo diinkubasi samalam dalam kalam pado suhu 4°C untuak mamastian adaptasi langkok pado kalam sabalun pangukuran. Larutan iko dimuek ka dalam spektrofotometer modular OLIS RSM1000 nan dilangkoki jo kisi-kisi api/garih 500 300 nm, celah masuak 1,24 mm, celah tangah 0,12 mm jo celah kalua 0,6 mm. Filter luluih panjang 600 nm dilatakkan pado pintu masuak tabuang foto sampel jo tabuang fotopangkali acuan untuak mangacualian cahayo eksitasi. Serapan dipantau pado 550 nm jo wakatu integrasi 0,15 s. Cahayo eksitasi dipancarkan dari LED M880F2 880 nm (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Inggris) malalui kabel serat optik jo intensitas 90% malalui kontroler DC2200 (Thorlabs Ltd., Inggris) dan dipancarkan ka sumber cahayo pado suduik 9°. Balok pangukuran dilawan jo camin untuak mambaliakan cahayo apo sajo nan awalnyo indak diserap dek sampel. Pantau absorbansi 10 s sabalun panarangan 50 s. Kudian absorbansi dipantau labiah lanjuik salamo 60 s dalam kalam untuak manilai sajauah ma kinolol sacaro spontan mangurangi sitokrom c23 + (caliak Gambar S8 untuak data mentah).
Data diproses jo caro mamasang laju awal linier dalam wakatu 0,5 inggo 10 s (tagantuang pado konsentrasi UQ2) jo maratoan laju dari katigo sampel pado satiok konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 nan dihituang jo koefisien kapunahan masiang-masiang digunoan untuak maubah laju manjadi efisiensi katalitik, diplot pado Origin Pro 2019 (OriginLab, Amerika Serikat), jo dipasang pado model Michaelis-Menten untuak manantuan nilai Km jo Kcat nan tampak.
Untuak pangukuran panyarapan panah, sampel RC-LH1 diencerkan inggo ~2μM dalam penyangga IMAC nan manganduang natrium askorbat 50 mM (Merck, Amerika Serikat) jo Terbutin 0,4 mM (Merck, Amerika Serikat). Asam askorbat digunoan sabagai donor elektron pangorbanan, jo tert-butaklofen digunoan sabagai panghambat QB untuak mamastian baso donor RC utamo tatap bakurang (yaitu, indak difotooksidasi) sapanjang proses pangukuran. Kiro-kiro 3 ml sampel ditambahkan ka sel baputa khusus (diameter sakitar 0,1 m, 350 RPM) jo panjang jalur optik 2 mm untuak mamastian baso sampel di jalur laser mampunyoi wakatu nan cukuik untuak adaptasi kalam antaro pulsa eksitasi. Gunoan pulsa laser ~100-fs untuak mampakuek sistem laser Ti: Safir (Fisika Spektra, Amerika Serikat) untuak mangganja sampel pado 880 nm pado laju pangulangan 1 kHz (20 nJ untuak NIR atau 100 nJ untuak Vis). Sabalun mangumpuakan data, paparan sampel ka cahayo eksitasi salamo sakitar 30 minik. Paparan akan manyababkan inaktivasi QA (mungkin mangurangi QA sakali atau duo kali). Tapi paralu diketahui bahaso proses ko bisa dibaliakkan karano sasudah maso adaptasi gelap nan lamo, RC akan lambek-lambek babaliak ka kegiatan QA. Spektrometer Helios (Sistem Ultracapek, Amerika Serikat) digunoan untuak mangukua spektrum panah jo wakatu panundaan -10 inggo 7000 ps . Gunoan parangkat lunak Surface Xplorer (Ultrafast Systems, Amerika Serikat) untuak mambukak kalompok data, kamudian manggabuangkan jo mambakukan. Gunoan paket parangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) untuak manggunoan himpunan data nan digabuangan untuak mandapekkan spektrum diferensial nan takaik jo peluruhan, atau gunoan fungsi nan malibaikkan babarapo eksponen jo tanggapan instrumen untuak manyasuaikan evolusi spektral panjang galombang tunggal di Asal (Asal, Amerika Serikat).
Sarupo nan disabuikan di ateh (53), disiapkan film fotosintesis nan manganduang kompleks LH1 nan kurang antena RC jo antena LH2 tepi. Membran diencerkan dalam tris 20 mM (pH 8,0) dan kamudian dimuek ka dalam kuvet kuarsa jo jalur optik 2 mm. Pulsa laser 30nJ digunoan untuak mangganja sampel pado 540 nm jo wakatu panundaan -10 inggo 7000 ps. Olah himpunan data sarupo nan dijalehkan untuak Rps. kawan contohnyo.
Membran dipelet jo caro sentrifugasi pado suhu 150.000 RCF salamo 2 jam pado suhu 4°C, dan kamudian absorbansinyo pado suhu 880 nm diasuspensi baliak dalam tris-HCl 20 mM (pH 8,0) jo NaCl 200 mM. Laruikkan membran jo caro diaduak lambek-lambek dalam 2% (w/v) β-DDM salamo 1 jam dalam kalam pado suhu 4°C. Sampel diencerkan dalam 100 mM trietilamonium karbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, Inggris) inggo konsentrasi protein 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pangolahan labiah lanjuik dilakukan dari metode nan alah dipublikasikan sabalunnyo (54), dimulai jo pangenceran 50 μg protein manjadi sabanyak 50 μl TEAB nan manganduang 1% (b/v) natrium laurat (Merck, Inggirih). Sasudah sonikasi salamo 60 s, dikurangi jo tris (2-karboksietil) fosfin (Merck, Inggirih) 5 mM pado suhu 37°C salamo 30 minik. Untuak S-alkilasi, inkubasi sampel jo metil S-metiltiometansulfonat 10 mM (Merck, Inggirih) dan tambahkan dari larutan saham isopropanol 200 mM salamo 10 minik pado suhu ruangan. Pencernaan proteolitik dilakukan jo manambahkan 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) dan diinkubasi pado suhu 37°C salamo 3 jam. Surfaktan laurate diekstraksi jo manambahkan 50 μl etil asetat jo 10 μl asam trifluoroasetat kelas LC (TFA; Thermo Fisher Ilmiah, Inggirih) dan diputar salamo 60 s. Pamisahan fase dipromosikan jo sentrifugasi pado 15.700 RCF salamo 5 minik. Manuruik protokol pambueknyo, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Inggris) digunoan untuak maaspirasi jo hati-hati jo maapuih garam dari fase bawah nan manganduang peptida. Sasudah dikariangan jo sentrifugasi vakum, sampel dilaruikkan dalam TFA 0,5% jo asetonitril 3%, jo 500 ng dianalisa jo kromatografi RP aliran nano nan ditambah jo spektrometri massa manggunoan parameter sistem nan dirincian sabalunnyo.
Gunokan MaksQuant v.1.5.3.30 (56) untuak identifikasi jo pangukuran protein untuak mancari Rps. basis data proteom palustris (proteom). Data proteomik spektrometri massa alah disimpan di Aliansi Pertukaran Proteome malalui repositori mitra PRIDE di bawah pangidentifikasi dataset PXD020402.
Untuak dianalisa jo RPLC nan ditambah jo spektrometri massa ionisasi elektrosemprot, kompleks RC-LH1 disusun dari Rps tipe liar. Manggunoan caro nan alah dipublikasikan sabalunnyo (16), konsentrasi protein nan dihasiakan pado sel palustris adolah 2 mg ml-1 dalam Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM jo 0,03% (b/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Manuruik protokol pambueknyo, gunoan alat pamurnian 2D (GE Healthcare, Amerika Serikat) untuak maekstraksi 10 μg protein jo metode pengendapan, dan laruikkan endapan dalam 20 μl asam formik (FA) 60% (v/v), 20% (v/v) Asetonitril/vv (20%). Limo mikroliter dianalisa jo RPLC (Dionex RSLC) nan ditambah jo spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gunokan kolom MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Inggris) untuak pamisahan pado suhu 60°C jo 100μlmin -1, jo gradien 85% (v/v) pelarut A [0,1% (v/v) pelarut FA jo 0,02% (v/v) larutan BFA/v a [0,1%(v/v) FA jo 0,02%(v/v) dalam TFA asetonitril 90%(v/v)] Manggunoan sumber ionisasi elektrosemprotan standar jo parameter bawaan salamo labiah dari 60 minik, spektrometer massa mandapekkan 100 inggo 2750 m/z (rasio massa-ka-muatan). Jo bantuan alat portal sumber daya bioinformatika ExPASy FindPept, petakan spektrum massa ka subunit kompleks.
Sel-sel ditumbuahan salamo 72 jam di bawah cahayo 100 ml NF-randah (10μMm-2 s-1), sadang (30μMm-2 s-1) atau tinggi (300μMm-2 s-1). Media M22 (media M22 dimano amonium sulfat dihilangkan dan natrium suksinat diganti jo natrium asetat) dalam botol sekrup 100 ml (23). Dalam limo siklus 30-s, manik-manik kaco 0,1 mikron dimanik-manikkan pado rasio volume 1:1 untuak malisis sel-sel jo didinginkan di ateh es salamo 5 minik. Bahan nan indak laruik, sel nan indak pacah jo manik-manik kaco dikaluakan jo sentrifugasi pado 16.000 RCF salamo 10 minik dalam mikrosentrifugasi bangku. Membran dipisahkan dalam rotor Ti 70,1 jo 100.000 RCF dalam tris-HCl 20 mM (pH 8,0) jo gradien sukrosa 40/15% (b/b) salamo 10 jam.
Sarupo nan dijalehkan dalam karya kami sabalunnyo, imunodeteksi tag Baliau pado PufW (16). Singkeknyo, kompleks inti nan dimurnikan (11,8 nM) atau membran nan manganduang konsentrasi RC nan samo (ditantuan jo oksidasi mangurangi spektrum pabedaan nan bakurang jo mancocokan beban pado gel nan diwarnai) dalam 2x penyangga pamuatan SDS (Merck, Inggirih) diencerkan duo kali. Protein-protein tu dipisahkan pado replika gel NuPage bis-tris 12% (Ilmiah Termo Fisher, Inggirih). Sabuah gel diwarnai jo Biru Brilian Coomassie (Bio-Rad, Inggirih) untuak mamuek jo mamvisualisasikan subunit RC-L. Protein pado gel kaduo dipindahan ka membran poliviniliden fluorida (PVDF) nan diaktifkan metanol (Thermo Fisher Scientific, Inggirih) untuak imunoassay. Membran PVDF diblokir dalam tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, susu bubuak skim Tween-20 0,2% (v/v) jo 5% (b/v), dan kamudian diinkubasi jo antibodi primer anti-His (dalam penyangga mH5 1:1000 A190-114A, Laboratorium Betil, Amerika Serikat) salamo 4 jam. Sasudah dicuci 3 kali dalam penyangga antibodi, membran digabuangan jo antibodi sekunder anti-tikus peroksidase lobak (diencerkan 1:10.000 dalam penyangga antibodi) (Sianagen, Italia) jo Pencitra 600 (Parawatan Kasehatan GE, Inggirih).
Dengan manggambar distribusi intensitas satiok gel nan bawarna atau jalur imunoassai, mangintegrasikan daerah di bawah puncak jo mahetong rasio intensitas RC-L (gel nan bawarna) jo Protein-W (imunoassay), di GambarJ (57) Olah gambar. Rasio-rasio iko diubah manjadi rasio molar jo maasumsikan baso rasio RC-L jo protein-W pado sampel RC-LH114-W murni adolah 1:1 jo manormalkan saluruah himpunan data sasuai.
Untuak bahan tambahan untuak artikel ko, silakan caliak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
Iko adolah artikel akses tabukak nan didistribusikan manuruik syarat Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel ko mamungkinkan panggunoan, distribusi, jo reproduksi nan indak tabateh dalam media apo sajo jo syarat karya aslinyo dikutip sacaro tapek.
Catatan: Kami hanyo mamintak Sanak untuak manyadiokan alamat email Sanak supayo urang nan Sanak rekomendasikan ka laman tu tahu baso Sanak nio inyo mancaliak email tu dan baso itu bukan spam. Kami indak akan manangkap alamat email apopun.
Pertanyaan ko digunoan untuak mauji apokah Sanak adolah pangunjuang dan mancagah pangiriman spam otomatis.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahayo 1 di pusat reaksi mambarikan wawasan baru tantang dinamika kinon.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahayo 1 di pusat reaksi mambarikan wawasan baru tantang dinamika kinon.
©2021 Asosiasi Amerika untuak Kamajuan Ilmu Pengetahuan. sagalo hak dilindungi. AAAS adolah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kamajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.